泌乳相關(guān)激素對乳酪蛋白在奶牛乳腺上皮細胞合成的影響及其調(diào)控機制.pdf

1、牛奶質(zhì)量安全已成為制約我國奶業(yè)健康發(fā)展的首要問題。乳蛋白是構(gòu)成牛奶營養(yǎng)品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，它既涉及乳品質(zhì)量安全，又是奶業(yè)核心競爭力的標(biāo)志。目前我國牛奶中乳蛋白的含量普遍偏低（平均為2.8％），不僅達不到奶牛的遺傳潛力，甚至低于國家標(biāo)準(zhǔn)(2.95％)。因此，立足我國現(xiàn)實的飼料資源，闡明內(nèi)源泌乳激素對乳蛋白合成與調(diào)控的機理，建立通過內(nèi)源激素調(diào)控改善牛奶品質(zhì)的理論和方法，已經(jīng)成為奶業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重要需求。
　　本研究以胰島素、催乳素和

2、氫化可的松為研究對象，以酶消化法培養(yǎng)得到的奶牛乳腺上皮細胞系為載體分別研究了胰島素、催乳素和氫化可的松對奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成的影響。
　　試驗一、選擇在揚州大學(xué)農(nóng)牧場飼養(yǎng)的健康泌乳期荷斯坦奶牛，活體無菌采取乳腺組織，以酶消化法分離、培養(yǎng)、純化奶牛乳腺上皮細胞，研究奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)效果。結(jié)果表明:以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中添加10％的胎牛血清、300IU/mL的雙抗、25ug/mL兩性霉素B、表皮生長

3、因子、ITS、氫化可的松、催乳素等組成的完全培養(yǎng)液中奶牛乳腺上皮細胞生長良好。上皮細胞顯微結(jié)構(gòu)顯示8代以內(nèi)，大多數(shù)奶牛乳腺上皮細胞在體外培養(yǎng)過程中呈卵圓形和多角形，細胞之間連接成片，且細胞界限明顯。熒光免疫細胞染色分析結(jié)果表明分離培養(yǎng)的乳腺上皮細胞幾乎全部呈陽性，四種酪蛋白基因PCR電泳產(chǎn)物結(jié)果清晰可見，這證實酶消化法得到的細胞是乳腺上皮來源，且具有正常生理功能，證明本試驗成功建立了奶牛乳腺上皮細胞系。
　　試驗二、以前期建立的奶

4、牛乳腺上皮細胞系為基礎(chǔ)，分別采用單因素5水平試驗設(shè)計研究了在培養(yǎng)液中添加不同濃度的催乳素(0、5、50、500、5000 ng/mL)、胰島素(0、5、50、500、5000 ng/mL)和氫化可的松(0、1、10、100、1000 ng/mL)對奶牛乳腺上皮細胞生長、細胞信號通路相關(guān)基因表達、乳蛋白合成相關(guān)激素受體基因表達和酪蛋白相對含量的影響。結(jié)果表明:①催乳素能顯著促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖、促進s-PRLR基因表達、促進κ-酪蛋

5、白和總酪蛋白的分泌(P＜0.05);在50 ng/mL之前，隨著添加量的增加，s-PRLR基因表達量、CSN3基因的表達量，κ-酪蛋白和總酪蛋白的相對含量也隨之增加，之后隨著PRL添加量的增加，其表達量和相對含量反而下降。②5-500 ng/mL的胰島素能顯著促進奶牛乳腺上皮細胞增殖;5-5000 ng/mL的胰島素均能顯著促進奶牛乳腺上皮細胞κ-酪蛋白和總酪蛋白的分泌，50 ng/mL的胰島素還能顯著促進CSN3基因的表達;在50 n

6、g/mL之前，隨著胰島素添加量的增加，INSR基因的表達量也隨之增加，之后隨著胰島素添加量的增加，其表達量反而下降。③24h之前，氫化可的松對奶牛乳腺上皮細胞的增殖無影響，24h之后1000 ng/mL的氫化可的松顯著抑制了奶牛乳腺上皮細胞的增殖;1-100 ng/mL的氫化可的松顯著增加了奶牛乳腺上皮細胞CSN3基因表達，1 ng/mL顯著增加了NR3C1基因表達，1-10 ng/mL的氫化可的松顯著增加了奶牛乳腺上皮細胞中κ-酪蛋白

7、和總酪蛋白的相對含量。
　　試驗三、以試驗二（單因素試驗）所得到的胰島素、催乳素和氫化可的松的最佳作用劑量為基礎(chǔ)，以前期凍存的奶牛乳腺上皮細胞為媒介，采用L9(34)正交試驗設(shè)計，研究了三種激素協(xié)同作用對奶牛乳腺上皮細胞增殖和凋亡的影響，對泌乳激素受體基因表達的影響，對乳蛋白合成影響重大的兩條信號通路中相關(guān)基因表達的影響及對κ-酪蛋白和總酪蛋白相對含量的影響，結(jié)果表明:①三種激素協(xié)同作用能顯著促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖;②5 ng

8、/mL催乳素、50 ng/mL胰島素和1 ng/mL氫化可的松能顯著增加mTOR、Rheb、PKB、PRAS40、STAT5a和P53基因的表達，三種激素對mTOR信號通路各基因表達的影響程度不一致，對JAK-STAT信號通路各基因表達影響的優(yōu)先次序為胰島素＞氫化可的松＞催乳素，即胰島素對JAK-STAT信號通路各基因表達的影響最大，其次是氫化可的松，最后是催乳素;③三種激素對s-PRLR基因表達影響的最優(yōu)組合為催乳素5 ng/mL、胰

9、島素50 ng/mL和氫化可的松1 ng/mL，對s-PRLR基因的影響程度為氫化可的松＞胰島素＞催乳素;對NR3C1基因表達影響的最優(yōu)組合為催乳素50 ng/mL、胰島素5 ng/mL和氫化可的松10 ng/mL，對NR3C1基因表達的影響程度為催乳素＞胰島素＞氫化可的松;對INSR基因表達影響的最優(yōu)組合為催乳素50 ng/mL、胰島素50 ng/mL和氫化可的松0.1 ng/mL，對INSR基因表達的影響程度為催乳素＞氫化可的松＞胰

10、島素。④三種激素促進CSN3基因表達、促進κ-酪蛋白和總酪蛋白分泌的最佳濃度組合為A1B2C2，即在奶牛乳腺上皮細胞中添加催乳素5 ng/mL、胰島素50 ng/mL、氫化可的松1 ng/mL時最有利于CSN3基因表達、κ-酪蛋白和總酪蛋白的分泌。
　　試驗四、以前期凍存的奶牛乳腺上皮細胞為載體，采用單因素4水平試驗設(shè)計，即分為對照組、LY294002組、AG-490組和雙阻斷劑組，通過對相關(guān)激素受體基因表達的測定，對兩條信號通路

11、中相關(guān)正向調(diào)節(jié)基因表達的測定，對酪蛋白基因和酪蛋白相對含量的測定來對前面得出的結(jié)論進行驗證。結(jié)果表明:在培養(yǎng)液中添加抑制劑極顯著的抑制了乳腺上皮細胞的增殖、誘發(fā)細胞凋亡;極顯著的抑制了mTOR信號通路和JAK-STAT信號通路中正向調(diào)節(jié)基因的表達;極顯著的抑制了奶牛乳腺上皮細胞中κ-酪蛋白和總酪蛋白的合成與分泌。
　　因此，本試驗得到的總體結(jié)論是:胰島素、氫化可的松和催乳素不論是單獨作用還是協(xié)同作用均可以促進奶牛乳腺上皮細胞生長和

12、乳蛋白合成。單獨作用時胰島素、催乳素和氫化可的松對奶牛乳腺上皮細胞生長和乳蛋白合成最有效的添加劑量分別是50、50和1ng/mL。胰島素、催乳素和氫化可的松協(xié)同作用對奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白合成影響的最佳組合為胰島素50 ng/mL、催乳素5 ng/mL和氫化可的松1 ng/mL，三種激素對不同指標(biāo)影響的優(yōu)先次序各不相同。泌乳激素對奶牛乳腺乳蛋白合成影響的作用機制是:①轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié):激素-激素受體-JAK-STAT信號通路調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育和