瘦素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的調(diào)控作用研究.pdf

1、本論文采用荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)手段，研究了leptin在有、無PRL的情況下對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的調(diào)控作用。研究結(jié)果分如下三個(gè)部分：
　　1.在體外采用酶消化法成功分離并培養(yǎng)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞，利用細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度進(jìn)行了純化和傳代培養(yǎng)，并將三代細(xì)胞凍存。對(duì)細(xì)胞特有的骨架蛋白-角蛋白進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞染色，確定為乳腺上皮細(xì)胞。對(duì)復(fù)蘇的細(xì)胞進(jìn)行了存活率檢測(cè)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為鵝

2、卵石樣成團(tuán)貼壁生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，此方法得到的細(xì)胞可以用于后續(xù)試驗(yàn)的研究。
　　2.在建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，進(jìn)行處理。分別設(shè)置有無(+、-)PRL的兩個(gè)對(duì)照組（leptin為0 ng/mL）和各自對(duì)應(yīng)的3個(gè)處理組（leptin分別為10、100、和1000ng/mL）。利用MTT法檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，在有、無PRL的條件下leptin呈時(shí)間依賴性促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖。且同一時(shí)間，有PRL時(shí)，高濃度（100

3、0 ng/mL）leptin處理組顯著抑制細(xì)胞增殖，10和100 ng/mL leptin處理組顯著促進(jìn)增殖，但是無PRL時(shí)，leptin的作用不顯著。
　　3.細(xì)胞的處理同第二部分，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究leptin對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中主要乳蛋白及其主要調(diào)控激素 PRL的受體和主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子基因表達(dá)的影響，并利用Elisa試劑盒測(cè)定主要酪蛋白的合成情況。試驗(yàn)結(jié)果表明：(1) leptin在有PRL的條件下才促進(jìn)乳蛋白基

4、因的表達(dá)，且促進(jìn)作用隨leptin濃度變化而不同。（2）有PRL的條件下，1000 ng/mL leptin抑制PRL受體基因的表達(dá)，但PRL明顯誘導(dǎo)其表達(dá)。（3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子JAK2的基因表達(dá)與乳蛋白一致，而STAT5沒有顯著變化。（4）leptin對(duì)α-酪蛋白合成沒有影響，在有PRL的條件下，10 ng/mL leptin處理組顯著促進(jìn)β-酪蛋白的合成，1000ng/mL處理組則顯著抑制。
　　本試驗(yàn)對(duì) leptin在奶牛乳腺