奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及應(yīng)用.pdf

1、本研究通過(guò)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法的篩選,培養(yǎng)出生理功能正常的奶牛乳腺上皮細(xì)胞,以該細(xì)胞為模型,研究棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、胞液脂質(zhì)小滴的形成、脂肪酸合成及其相關(guān)酶基因表達(dá)的影響. 從荷斯坦奶牛乳房無(wú)菌采取乳腺組織,通過(guò)不同的方法分離、培養(yǎng)、純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞,研究奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)效果.結(jié)果表明:組織塊接種、0.25﹪的胰酶和100u/mI,透明質(zhì)酸酶的混合液37℃消化組織塊3h,可以

2、得到大量細(xì)胞用于原代培養(yǎng).在以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,在培養(yǎng)液中添加10﹪的胎牛血清、100ug/mI,的雙抗、表皮生長(zhǎng)因子(10ng/mI.)、胰島素(0.5ug/mI.)、氫化可的松(1u咖L)、孕酮(1u咖L)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(5ug/m!.入谷氨酰胺(0.3m咖L)等,組成的完全培養(yǎng)液中奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)良好.顯微結(jié)構(gòu)顯示:奶牛乳腺上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中含有不同的細(xì)胞類型,大多數(shù)上皮細(xì)胞呈多角形,細(xì)胞之間連接成片,細(xì)胞界限明顯,部分

3、細(xì)胞界限不明顯. 用Western.blotting檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌的B.酪蛋白,以鑒定該細(xì)胞的生理功能是否正常;通過(guò)染色體的數(shù)目及核型分析以鑒定體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)化.結(jié)果顯示:培養(yǎng)液中含有B.酪蛋白,說(shuō)明該乳腺上皮細(xì)胞生理狀況良好;染色體數(shù)目正常,染色體數(shù)目為60,核型與哺乳動(dòng)物染色體圖譜一致,說(shuō)明該細(xì)胞系在體外培養(yǎng)條件下未發(fā)生轉(zhuǎn)化. 在奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中添加游離脂肪酸,包括棕櫚酸、硬脂

4、酸、油酸、亞油酸,研究外源脂肪酸對(duì)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、胞液中脂質(zhì)小滴的形成、細(xì)胞脂肪酸合成以及脂肪酸合成關(guān)鍵酶ACC、FAS、FAT/CD36和SCDmRNA表達(dá)量的影響.結(jié)果顯示,棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)都有抑制作用,抑制作用隨著脂肪酸的添加量和不飽和程度的增加而增加;油酸、亞油酸對(duì)胞液中脂質(zhì)小滴的合成有促進(jìn)作用,而棕櫚酸、硬脂酸沒(méi)有這種作用;棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸都能抑制細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的從頭合成;棕櫚酸、硬脂酸、油