沼澤型水牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系建立及永生化研究.pdf

1、本研究目的是構(gòu)建永生化的水牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系，為今后研究水牛乳腺組織發(fā)育和泌乳生理功能調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。實驗以泌乳期沼澤型水牛的乳腺組織為材料，進行了如下研究： 實驗一，探討了水牛乳腺上皮細胞分離、純化培養(yǎng)方法及細胞的特性。選取處于泌乳期沼澤型水牛的乳腺組織分別采用組織塊接種法和酶消化法分離培養(yǎng)原代水牛乳腺上皮細胞。利用乳腺上皮細胞與成纖維細胞對胰蛋白酶的敏感性不同和細胞貼壁時間差進行分離純化，獲得純?nèi)橄偕掀ぜ毎?。形態(tài)觀

2、察發(fā)現(xiàn)純化后乳腺上皮細胞呈鵝卵石狀，具有典型上皮細胞的形態(tài)特征；染色體核型分析表明，染色體數(shù)目48(2n)條，與沼澤型水牛染色體數(shù)目相符；熒光免疫細胞染色法表明，培養(yǎng)的乳腺上皮細胞具有角蛋白-8的特異性表達，且在雌二醇激素的誘導下能表達出a-酪蛋白。 實驗二，探討了水牛乳腺上皮細胞永生化的方法。利用實驗一所獲得的水牛乳腺上皮細胞系，采用DNA-磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染法，將SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染純化后第4代的水牛乳腺上皮細胞，經(jīng)過篩選后繼續(xù)培養(yǎng)

3、，細胞的輪廓變大，但生長速度無明顯改變(差異不顯著，P>0.05)，到目前為止細胞總共已傳了15代，細胞生長狀況良好。經(jīng)過端粒重復序列擴增(TRAP)-銀染法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞的端粒酶活性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后細胞的端粒酶活性要比未轉(zhuǎn)染前的高。 實驗三，探討了雌激素受體α、催乳素受體在永生化水牛乳腺上皮細胞中的表達情況和不同濃度雌二醇對水牛乳腺上皮細胞增殖的影響。根據(jù)NCBI上發(fā)表的奶牛雌激素受體α基因和催乳素受體基因cDNA序列，設(shè)計

4、兩對特異性引物，用RT-PCR從永生化水牛乳腺上皮細胞系擴增水牛雌激素受體α基因和催乳素受體基因部分序列。結(jié)果擴增出雌激素受體α基因序列為171bp，催乳素受體基因序列為253bp，與奶牛的同源性分別為100％和99.2％。證實了永生化水牛乳腺上皮細胞與原代細胞一樣，仍能表達雌激素受體和催乳素受體。采用MTT法檢測不同濃度雌二醇對水牛乳腺上皮細胞增殖的影響，結(jié)果得到濃度為5mg/L處理組的增殖效果最佳，差異顯著(P<0.05)。

5、 以上結(jié)果表明：(1)用組織塊接種法比酶消化法更易獲得原代的水牛乳腺上皮細胞；(2)經(jīng)過熒光免疫細胞染色、α-酪蛋白PCR鑒定和染色體核型分析證實所獲得的細胞為水牛乳腺上皮細胞，且具有正常分泌酪蛋白的功能；(3)通過DNA-磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染使SV40在水牛乳腺上皮細胞中得到表達，細胞的端粒酶活性高于未轉(zhuǎn)染前，成功建立了永生化沼澤型水牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系；(4)經(jīng)過SV40轉(zhuǎn)染后水牛乳腺上皮細胞仍表達雌激素受體α和催乳素受體；(5)