王不留行、黃芪對奶牛乳腺上皮細胞體外增殖與分泌功能影響的研究.pdf

1、本論文研究了中草藥黃芪、王不留行對奶牛乳腺上皮細胞體外增殖和乳蛋白合成的影響，并對其具體機制作了初步探索。首先建立奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)出具有正常生理功能的奶牛乳腺上皮細胞，并以該細胞系為模型，篩選對乳腺細胞體外生長有促增殖效應的中草藥，確定其適宜的作用濃度和作用時間，在此基礎上，進一步研究中草藥王不留行、黃芪對乳腺細胞一系列生物活性的影響及其作用機理。 本研究包括五個部分： 1.奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體

2、系的建立 采用組織塊培養(yǎng)法、聯(lián)合應用差酶消化法和反復貼壁法建立體外奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系，采用透射電鏡、免疫組化、免疫印跡等試驗技術方法對乳腺上皮細胞特性進行檢測。試驗結果表明，運用本方法建立的奶牛乳腺細胞系上皮特性及分泌功能特征完備。 2.七味中草藥粗提液對奶牛乳腺上皮細胞促增殖作用的比較研究 研究比較七味中草藥對奶牛乳腺上皮細胞體外生長的促增殖效應。確定黃芪、王不留行、當歸、川芎、栝樓、漏蘆和續(xù)斷粗提物為備

3、篩藥物，采用2-3代奶牛乳腺上皮細胞(CMEC)為試驗材料，在細胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的上述中草藥提取液，采用MTT比色法，比較其對細胞增殖的促進作用。試驗結果表明，與對照組相比，濃度分別為10 mg/mL的王不留行，20 mg/mL的黃芪，10 mg/mL+20 mg/mL的王不留行黃芪混合物均可極顯著地促進乳腺上皮細胞生長(p<0.01)，尤以10 mg/mL +20mg/mL的王不留行黃芪配伍組作用效果最好。 3.王不留行

4、與黃芪促進奶牛乳腺上皮細胞增殖調控機理的初步研究 試驗以2-3代奶牛乳腺上皮細胞(CMEC)為試驗模型，采用流式細胞儀、免疫組織化學染色法，檢測王不留行(10 mg/mL)、黃芪(20 mg/mL)、王不留行黃芪配伍(10 mg/mL+20 mg/mL)對乳腺上皮細胞增殖周期分布、ClycinD1、p27蛋白在乳腺上皮細胞內陽性表達的影響。試驗結果表明，與對照組相比，濃度分別為10 mg/mL的王不留行，20 mg/mL的黃芪，

5、10 mg/mL+20 mg/mL的王不留行黃芪配伍均可促進乳腺上皮細胞細胞周期G1/S期轉換(p<0.01)，增加細胞周期中S期細胞的數目(p<0.01)，CyclinD1的陽性表達均得到上調(p<0.01)，p27的陽性表達均下降(p<0.01)，尤以王不留行黃芪配伍作用明顯。結果提示，黃芪、王不留行促進乳腺細胞的增殖，是通過上調CyclinD1表達、下調p27表達水平，進而加速細胞周期G1/S期的轉換完成的. 4.王不留行

6、與黃芪對奶牛乳腺上皮細胞體外分泌性能的影響 本試驗研究了中草藥黃芪、王不留行對奶牛乳腺上皮細胞體外分泌性能的影響。以2-3代奶牛乳腺上皮細胞(CMEC)為試驗模型，研究中草藥黃芪、王不留行作用前后細胞內部超微結構的變化、細胞裂解液中氨基酸總濃度及組分的變化規(guī)律，以及細胞裂解液中蛋白總濃度的變化，試驗結果表明，與空白對照組相比，王不留行(10 mg/mL)、黃芪(20 mg/mL)、王不留行與黃芪配伍(10 mg/mL+20 mg

7、/mL)作用于細胞后，細胞內部超微結構發(fā)生了重塑，表現(xiàn)出更多功能分泌分化的特征標志；細胞裂解液中氨基酸的總濃度均得到提高(p<0.01)，細胞裂解液中游離氨基酸的總濃度均顯著或極顯著地提高(王不留行(10 mg/mL)、王不留行黃芪配伍(10 mg/mL +20mg/mL)，p<0.01；黃芪(20 mg/mL)，P<0.05；)；細胞裂解液中蛋白總合量亦有明顯的增高，(王不留行(10 mg/mL)、王不留行黃芪配伍(10 mg/mL

8、+20 mg/mL)，p<0.01；黃芪(20 mg/mL)，P>0.05；)。結果提示，中草藥黃芪、王不留行可通過對乳腺細胞內部超微結構的重塑、促進乳腺細胞吸收胞外游離氨基酸，使乳腺細胞蛋白合成增多。 5.王不留行與黃芪對奶牛乳腺上皮細胞合成乳鐵蛋白和酪蛋白的影響 本試驗以2-3代奶牛乳腺上皮細胞(CMEC)為試驗模型，應用熒光定量RT-PCR技術研究了中草藥王不留行、黃芪對乳腺細胞as1-酪蛋白、B-酪蛋白和乳鐵蛋白

9、基因表達的影響；應用ELISA競爭抑制性法檢測，王不留行、黃芪作用前后乳腺細胞裂解液中as1-酪蛋白、B-酪蛋白和乳鐵蛋白含量的變化。試驗結果表明，與空白對照組相比，王不留行黃芪配伍(10 mg/mL+20 mg/mL)、王不留行(10 mg/mL)均極顯著提高as1-酪蛋白mRNA的表達(p<0.01)，黃芪(20 mg/mL)組細胞as1-酪蛋白mRNA表達稍低于空白對照組，差異不顯著(P>0.05)；王不留行黃芪配伍(10 mg/

10、mL +20mg/mL)、王不留行(10 mg/mL)均顯著提高B-酪蛋白mRNA的表達(p<0.05)，黃芪(20 mg/mL)組細胞B-酪蛋白mRNA表達稍高于空白對照組，差異不顯著(P>0.05)；王不留行黃芪配伍(10 mg/mL+20 mg/mL)顯著提高乳鐵蛋白mRNA的表達(p<0.05)，王不留行(10 mg/mL)組和黃芪(20 mg/mL)組細胞乳鐵蛋白mRNA的表達稍高于空白對照組，差異不顯著(P>0.05).as

11、1-酪蛋白合成量的檢測結果表明，黃芪(20mg/mL)+王不留行(10 mg/mL)配伍作用效果較明顯，其組內乳腺細胞as1-酪蛋白合成量顯著高于空白對照(P<0.05)；而黃芪(20 mg/mL)組和王不留行(10 mg/mL)組相比較于空白對照組，組內乳腺細胞as1-酪蛋白合成量略有增高，差異不顯著(P>0.05)。B-酪蛋白合成量的檢測結果表明，黃芪(20 mg/mL)+王不留行(10 mg/mL)配伍組和王不留行(10 mg/m

12、L)組細胞B-酪蛋白合成量顯著高于空白對照組(P<0.05)，黃芪(20 mg/mL)組細胞B-酪蛋白合成量略高于空白對照組，但差異不顯著(P>0.05)。乳鐵蛋白合成量的檢測結果表明，與空白對照組比較，中草藥作用細胞后，乳腺細胞乳鐵蛋白合成量均略有增高，但差異不顯著(P>0.05)。 以上五個試驗部分的研究結果表明：中草藥黃芪、王不留行促進乳腺細胞as1-酪蛋白、B-酪蛋白和乳鐵蛋白的合成，其潛在機制與其能夠促進乳腺上皮細胞增