奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及TNF-α對其凋亡影響的研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱程序化細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD），是細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身程序，由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式，它與細(xì)胞增殖的動態(tài)平衡在維系生物體生長發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。許多因素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）主要通過死亡受體路徑來誘導(dǎo)凋亡，分為TNF—α和TNF—β兩種，前者來自單核巨噬

2、細(xì)胞，后者由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，而有關(guān)TNF—α對奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡影響的研究，國內(nèi)外尚未見報道。 本實驗采用三種不同的方法培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，組織塊法、分離單細(xì)胞法培養(yǎng)出的原代細(xì)胞，經(jīng)姬姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點，結(jié)合上皮細(xì)胞特異性角蛋白-18單克隆抗體對體外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為奶牛乳腺上皮細(xì)胞，而機械破碎法未獲得奶牛乳腺上皮細(xì)胞。用純化后的原代乳腺上皮細(xì)胞作為模型研究TNF—α對其致凋亡作用，實驗應(yīng)用

3、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL五種劑量的腫瘤壞死因子—α（TNF—α）作用體外培養(yǎng)的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，分別于3h、6h、24h、48h和72h后，采用分光光度法檢測Caspase—3酶活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測磷脂酰絲氨酸（Ps），二苯胺反應(yīng)法（DPA）測DNA片段化，結(jié)果表明：TNF—α對奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡有明顯誘導(dǎo)作用，并呈濃度依賴型，凋亡的不同階段與TNF—α作用的時間密切相關(guān)。TNF

4、—α能誘導(dǎo)caspase—3的激活，該過程可能是TNF—α誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟之一，且Caspase—3活化是細(xì)胞即將發(fā)生凋亡之前的生化改變；TNF—α誘導(dǎo)的早期凋亡細(xì)胞主要發(fā)生在24h，在48h、72h主要以晚期凋亡和壞死細(xì)胞為主，而總的凋亡和壞死比率在24h以后隨時間的延長而增大，呈時間依賴性；二苯胺反應(yīng)法檢測發(fā)現(xiàn)DNA片段化百分率在6h時降低，24h以后逐漸升高，呈時間依賴性，與流式細(xì)胞儀檢測的總的凋亡和壞死比率一致；