馬鈴薯莖尖玻璃化法超低溫保存及其遺傳穩(wěn)定性研究.pdf

1、玻璃化法超低溫保存技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、適用材料廣泛、保存效果好,成為長(zhǎng)期穩(wěn)定保存植物種質(zhì)資源的有效方法之一。馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是現(xiàn)今人類社會(huì)的第三大糧食作物,僅次于水稻和小麥。保存馬鈴薯種質(zhì)資源是選育新品種的原始材料和物質(zhì)基礎(chǔ)。國(guó)際上有關(guān)馬鈴薯種質(zhì)資源的超低溫保存已有大量研究,并且在多個(gè)國(guó)家已建立馬鈴薯超低溫基因庫(kù),如德國(guó)國(guó)家種質(zhì)資源與育種中心、秘魯國(guó)際馬鈴薯中心、韓國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)生物多樣性研究中心等。但是,目

2、前中國(guó)對(duì)于馬鈴薯種質(zhì)資源超低溫保存的研究報(bào)道較少。因此,本研究目的在于優(yōu)化并建立馬鈴薯種質(zhì)資源的玻璃化法超低溫保存技術(shù),為馬鈴薯種質(zhì)資源超低溫基因庫(kù)的建立提供技術(shù)支撐。
　　本試驗(yàn)以4個(gè)馬鈴薯基因型“青薯9號(hào)”“大西洋”“紫花白”“E107”的脫毒試管苗為材料,對(duì)馬鈴薯莖尖玻璃化法超低溫保存的條件進(jìn)行了研究。另外研究了超低溫保存前后馬鈴薯材料的遺傳穩(wěn)定性,探討了超低溫保存對(duì)馬鈴薯DNA甲基化的影響。主要研究結(jié)果如下:
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3、.通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化影響超低溫保存馬鈴薯莖尖成活率和再生率的關(guān)鍵因素,成功地建立了馬鈴薯玻璃化法超低溫保存體系。馬鈴薯莖尖玻璃化法技術(shù)要點(diǎn)是:從30-40 d苗齡的健康植株上剝?nèi)?-3 mm(含有1-2個(gè)葉原基)左右馬鈴薯莖尖,在含有0.04mg/L KT和0.1 mol/L Sucrose的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)4h后,室溫下裝載液(含2 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖)裝載40min,于0℃下用PVS2處理35 min,加少量新鮮的P

4、VS2后迅速注入液氮,投入液氮罐進(jìn)行保存(液氮中保存至少24h);超低溫保存后的莖尖在室溫下浸入含有1.2 mol/L蔗糖恢復(fù)培養(yǎng)液90 s進(jìn)行解凍,并卸載25 min,轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基中,暗培養(yǎng)10d后進(jìn)行弱光培養(yǎng),最后轉(zhuǎn)到正常光照條件下再生成苗。
　　2.運(yùn)用該優(yōu)化體系對(duì)四個(gè)基因型的馬鈴薯莖尖進(jìn)行超低溫保存,“青薯9號(hào)”“大西洋”“紫花白”“E107”的成活率分別為86.93％、78.03%、71.57%和65.82%,再生率分

5、別為77.05%、48.02%、49.45%和40.95%,成活率和再生率因基因型而異,且不同基因型之間的差異顯著。
　　3.從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩個(gè)方面對(duì)超低溫保存前后的馬鈴薯材料進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的鑒定,結(jié)果如下:
　?、?超低溫保存后再生植株的葉型、葉色、株型、花色與對(duì)照無(wú)異;此外,大田收獲的薯塊在薯型和薯色也與對(duì)照無(wú)區(qū)別;
　?、?運(yùn)用簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)技術(shù)對(duì)保存后的再生材料和對(duì)照組的 DNA進(jìn)行分析。結(jié)果表明

6、,從30對(duì)引物中篩選出的10對(duì)引物,每對(duì)引物均能獲得6條以上的擴(kuò)增條帶,共獲得314條擴(kuò)增帶,與對(duì)照植株比較,未發(fā)現(xiàn)有差異片段,表明材料基因組 DNA序列在超低溫保存過(guò)程并未發(fā)生變化。
　　4.應(yīng)用甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)標(biāo)記技術(shù)分析超低溫保存前后材料的甲基化水平情況。結(jié)果表明:用16對(duì)引物組合對(duì)4個(gè)基因型進(jìn)行擴(kuò)增,平均擴(kuò)增出493條帶;與對(duì)照相比,4個(gè)基因型的CCGG序列中有8.4%-14.3%DNA發(fā)生甲基化變化。經(jīng)超低