龍眼、荔枝胚性培養(yǎng)物超低溫保存研究.pdf

1、龍眼、荔枝同屬無(wú)患子科，是南方重要熱帶亞熱帶特產(chǎn)果樹。本研究以龍眼、荔枝胚性培養(yǎng)物為材料，進(jìn)行龍眼、荔枝玻璃化超低溫保存方法研究；同時(shí)，以龍眼胚性培養(yǎng)物為材料，進(jìn)行超低溫保存過程中低溫預(yù)培養(yǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以進(jìn)一步探索超低溫保存機(jī)理。主要研究結(jié)果如下： 1．龍眼、荔枝胚性培養(yǎng)物的玻璃化超低溫保存技術(shù)體系 以龍眼胚性培養(yǎng)物為供試材料，探討繼代培養(yǎng)時(shí)間、化凍方式、不同發(fā)育階段低溫預(yù)培養(yǎng)對(duì)龍眼胚性培養(yǎng)物玻璃化超低溫保存的影響

2、。試驗(yàn)結(jié)果表明，繼代培養(yǎng)12～15 d的龍眼胚性愈傷組織用于玻璃化超低溫保存，可獲得較高的細(xì)胞活力；40℃溫水浴、25℃左右室溫和自來水沖洗3種不同的化凍方式對(duì)龍眼胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存后的存活率影響差異不大；球形胚玻璃化超低溫保存后的細(xì)胞活力，比正常的胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存后的細(xì)胞活力高。 以荔枝胚性愈傷組織為供試材料，探討低溫預(yù)培養(yǎng)、化凍方式以及光照條件對(duì)荔枝胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存的影響。結(jié)果表明荔枝胚性愈

3、傷組織5℃低溫預(yù)培養(yǎng)2 d再進(jìn)行超低溫保存，采用40℃溫水浴化凍和自來水流水沖洗化凍都能明顯提高保存后的細(xì)胞活力；超低溫保存后的培養(yǎng)物置于黑暗中進(jìn)行為期15 d的恢復(fù)生長(zhǎng)，然后轉(zhuǎn)到正常光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，能使超低溫保存后的荔枝愈傷組織較快地恢復(fù)生長(zhǎng)，細(xì)胞存活率較高。 2．龍眼、荔枝胚性愈傷組織 玻璃化超低溫保存后的體胚發(fā)生與植株再生龍眼、荔枝胚性愈傷組織經(jīng)玻璃化超低溫保存后均能進(jìn)行正常的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，與超低溫保存前正常

4、的胚性愈傷組織體胚發(fā)生數(shù)量接近，并且體胚能完成正常分化，形成形態(tài)正常、粗壯的完整再生植株，表明龍眼、荔枝胚性愈傷組織經(jīng)玻璃化超低溫保存后，在體胚發(fā)生與再生植株能力方面沒有產(chǎn)生明顯變化。 3．龍眼、荔枝胚性愈傷組織 玻璃化超低溫保存后遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)利用RAPD技術(shù)從DNA分子水平對(duì)玻璃化超低溫保存的龍眼、荔枝胚性愈傷組織進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。篩選了10條隨機(jī)引物，對(duì)玻璃化超低溫保存前和保存后的胚性愈傷組織基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)

5、增。檢測(cè)結(jié)果表明，超低溫保存的體細(xì)胞無(wú)性系遺傳穩(wěn)定性基本得到保持，但也發(fā)現(xiàn)存在小量的變異現(xiàn)象，有個(gè)別引物擴(kuò)增的譜帶，在超低溫保存前和超低溫保存后存在一些差異。其中，龍眼胚性愈傷組織超低溫保存后的變異率為3.0～3.5％，荔枝胚性愈傷組織超低溫保存后的變異率為7.48％。玻璃化超低溫保存后產(chǎn)生的遺傳變異與超低溫保存過程中環(huán)境脅迫有關(guān)。 4．低溫預(yù)培養(yǎng)對(duì)龍眼球形胚存活力和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 玻璃化超低溫保存前的低溫預(yù)培養(yǎng)對(duì)保存

6、后球形胚活力與蛋白質(zhì)的表達(dá)有直接的關(guān)系。在5℃預(yù)培養(yǎng)4 d時(shí)，超低溫保存后的球形胚活力最高，達(dá)82.58％，此時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)情況為新誘導(dǎo)4個(gè)蛋白點(diǎn)，上調(diào)表達(dá)1個(gè)蛋白點(diǎn)，新誘導(dǎo)與上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)數(shù)最多，共5個(gè)蛋白點(diǎn)；在低溫預(yù)培養(yǎng)6 d時(shí)，超低溫保存后的球形胚活力反而下降，為70.25％，此時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)情況為消失4個(gè)蛋白點(diǎn)，下調(diào)表達(dá)153個(gè)蛋白點(diǎn)數(shù)，消失與下調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)數(shù)達(dá)157個(gè)。新誘導(dǎo)和上調(diào)表達(dá)的蛋白增強(qiáng)了細(xì)胞的抗凍能力，使超低溫保存后

7、的存活率提高。消失和下調(diào)表達(dá)的蛋白導(dǎo)致細(xì)胞的抗凍能力減弱，由此引起超低溫保存后的存活率下降。表明龍眼體胚超低溫保存前的低溫預(yù)培養(yǎng)以5℃、4 d為最佳。 5．低溫預(yù)培養(yǎng)特異表達(dá)蛋白的生物質(zhì)譜鑒定與功能分析 對(duì)龍眼LC<,2>球形胚5℃低溫預(yù)培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的特異表達(dá)蛋白LLT1、LLT<,2>、LLT3和LLT4，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋分析，匹配分析結(jié)果表明：LLT3