百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存技術(shù)的研究.pdf

1、本研究以百子蓮胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料，通過(guò)試驗(yàn)得出以下結(jié)論:
　　(1)建立了百子蓮胚性愈傷組織的玻璃化法超低溫保存體系。取繼代培養(yǎng)20 d后的百子蓮胚性愈傷組織50±10 mg，在4℃低溫條件下、0.5 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d，然后在室溫下將250±10 mg胚性愈傷組織放入含2mL裝載液的冷凍管中處理60min，去除裝載液后，在0℃條件下放入2 mL玻璃化溶液(PVS2)處理40 min，快速投入液氮1h后，于

2、40℃水浴中解凍90 s，快速吸除PVS2溶液后，用去裝載液洗滌3次，每次間隔10 min，置于恢復(fù)培養(yǎng)基上24 h后，測(cè)定細(xì)胞成活率(TTC)達(dá)56.9％，胚性愈傷組織能夠正常增殖。
　　(2)利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)恢復(fù)培養(yǎng)55 d后的百子蓮胚性愈傷組織遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用8個(gè)正向引物和8個(gè)反向引物組合成64對(duì)組合，對(duì)隨機(jī)選取的供試樣品進(jìn)行了AFLP分析，結(jié)果表明經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)后，共分離得到3086個(gè)條

3、帶，其中有6個(gè)差異條帶，變異率低于1％。
　　(3)研究了百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存過(guò)程中含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化規(guī)律，并對(duì)各生理指標(biāo)之間以及生理指標(biāo)與細(xì)胞成活率之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:在投入液氮冷凍前，含水量顯著降低到41.5％，恢復(fù)培養(yǎng)24 h后，含水量迅速回升;相對(duì)電導(dǎo)率與丙二醛的變化規(guī)律相一致，均從預(yù)培養(yǎng)到快速解凍過(guò)程中持續(xù)上升，至恢復(fù)培養(yǎng)24h后

4、緩慢下降;可溶性糖含量呈雙峰曲線變化;淀粉和可溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)相似，均呈先下降，后上升，再下降的變化。多元相關(guān)分析表明:相對(duì)電導(dǎo)率與丙二醛呈顯著正相關(guān);細(xì)胞存活率與相對(duì)電導(dǎo)率呈極顯著負(fù)相關(guān)，與丙二醛呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.999和-0.896。說(shuō)明在百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存過(guò)程中，膜質(zhì)傷害對(duì)細(xì)胞成活率的影響最大。
　　(4)添加外源抗氧化劑對(duì)提高細(xì)胞成活率至關(guān)重要。與不添加的對(duì)照相比，褪黑素、脫落酸、谷