地黃試管塊根誘導(dǎo)及莖尖玻璃化法超低溫保存.pdf

1、玻璃化凍存法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種植物資源超低溫保存方法,但地黃的低溫保存研究尚未見(jiàn)報(bào)道.因此,該研究選用地黃"85-5"為試驗(yàn)材料,開(kāi)展了試管地黃的誘導(dǎo)及莖尖玻璃化法超低溫保存的初步研究.所取得的主要研究結(jié)果如下:1.試管地黃的形成包括不定根的形成及塊根膨大兩個(gè)主要時(shí)期.塊根的形成前提必須首先有不定根的發(fā)生,低濃度的6-BA和NAA配合使用可誘導(dǎo)植株產(chǎn)生不定根,以MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L效果較好.2.試管地黃的形

2、態(tài)建成與內(nèi)源生長(zhǎng)物質(zhì)的變化相關(guān).IAA在不定根膨大初期含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),20d時(shí)開(kāi)始緩慢上升.GA<,3>在轉(zhuǎn)苗初期呈現(xiàn)較平穩(wěn)的趨勢(shì),在25-30d時(shí)GA<,3>的含量迅速增長(zhǎng),而長(zhǎng)則呈下降趨勢(shì),但依然處于較高水平.ABA的含量在10-20d塊根膨大時(shí)呈緩慢上升趨勢(shì),20d-30d塊根迅速膨大期迅速增長(zhǎng),30d以后含量較為平穩(wěn),較高的內(nèi)源ABA含量有利于地黃塊根的膨大.JA在不定根膨大初期處于較低水平,以后則一直呈緩慢的上升趨勢(shì),在試管

3、地黃迅速膨大時(shí)期,JA在根中的含量最高,JA在地黃離體塊根的形成過(guò)程中有可能起著極為重要的作用.3.以無(wú)菌苗葉片為外植體,地黃在組織培養(yǎng)條件下的形態(tài)建成受內(nèi)源生長(zhǎng)物質(zhì)的調(diào)控.試驗(yàn)觀察到,在MS+6-BA2.0mg/L培養(yǎng)基中可直接誘導(dǎo)小植株的再生,這一過(guò)程中,培養(yǎng)初期內(nèi)源IAA的含量略下降,7d后急劇增長(zhǎng),當(dāng)不定芽形成后,IAA的含量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì);GA<,3>的含量在培養(yǎng)1-14d呈增高趨勢(shì),14d則急劇下降;JA的含量整體變化幅度不

4、明顯.4.試管地黃在形態(tài)解剖方面與自然條件下生長(zhǎng)的地黃具有一致性,兩者的成熟結(jié)構(gòu)基本上相同.在橫切面上,二者都分為周皮和維管組織兩部分,周皮的構(gòu)成(木栓層、栓內(nèi)層、木栓形成層)基本一致,維管柱中各種組織細(xì)胞在結(jié)構(gòu)或數(shù)量上均相似.因此,試管地黃在誘導(dǎo)過(guò)程中其結(jié)構(gòu)上未發(fā)生明顯變化.5.建立了地黃莖尖超低溫保存的技術(shù)體系.切取10mm長(zhǎng)的地黃脫毒苗莖尖接種于含0.2-0.6mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上,并添加1﹪-5﹪乙酰胺、5﹪DMSO;在

5、黑暗、10℃條件下預(yù)培養(yǎng)1-5d后,切取0.5-3.5mm長(zhǎng)的莖尖,用60﹪PVS<,2>在25℃下裝載25min,然后用100﹪PVS<,2>于0℃脫水處理10-50min,換入新鮮的PVS<,2>,迅速投入液氮(LN)中,24h后取出于40℃水浴中化凍,立即用1.2mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基洗滌2次,每次10min,然后用氯化三苯基四氮唑(TTC)法檢測(cè)成活率,或接種于MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.02mg/L+3﹪蔗