草莓莖尖超低溫脫毒處理及其病毒檢測研究.pdf

1、本文以三個草莓(Fragaria×ananassa Duch.)品種為試驗材料，用草莓的匍匐莖莖尖為外植體建立草莓無菌繁殖體系，并對其進行病毒檢測及脫毒處理。研究的主要目的是對莖尖培養(yǎng)脫除幾種草莓常見病毒(SCV，SMoV，SMYEV，SVBV)的脫毒方式和PCR病毒檢測體系的改良和優(yōu)化。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、挪葺俁NA提取方法的優(yōu)化。提取草莓葉片中優(yōu)質(zhì)的總RNA，改良CTAB法與植物RNAOUT及植物柱式RNAOUT相比

2、，無論從提取的RNA質(zhì)量和純度上（OD260/OD230，OD260/OD280的值分別約為1.9和2.0，濃度也達到20mg/ml以上），還是從它的成本上，都不失為本試驗中最佳提取總RNA的方法。
　?、扑姆N植物病毒特異片段和植物內(nèi)源mRNA?；瘍?nèi)標的篩選及多重PCR引物的設計。用于PCR檢測的引物對最終確定為SD1/SD2、D1/D3、Y1/Y2、SVl/SV2、N1a/N1b、N1a/N2b，后兩個為分別來自‘顛茄’的線粒體

3、NADH脫氫酶ND2亞基上基因的特異內(nèi)標引物，目的片段的大小分別為345bp、219bp、271bp、422bp，571bp和188bp。
　　⑶多重PCR反應體系的優(yōu)化及四種植物病毒檢測方法的建立。PCR反應體系的優(yōu)化包括20μl體系和程序設計。獲得的最佳RT-PCR草莓病毒檢測體系為:1μl cDNA、10×PCR buffer、1.5mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.5U Taq酶，引物濃度0.

4、1μmol/L，用超純水補充至20μl; PCR程序:94℃預變性5min，94℃變性1min，54℃退火40s，68℃延伸1.5min，35個循環(huán)，68℃再延伸10min。
　?、炔葺o尖超低溫脫毒體系的建立。通過莖尖培養(yǎng)結合超低溫處理的方法對檢測含有相應病毒的草莓進行脫毒，通過對影響超低溫處理過程中莖尖成活率的幾個主要因素進行研究，篩選出適合的脫毒方式，便于生產(chǎn)應用。以‘豐香’草莓莖尖為材料，對影響超低溫處理過程中莖尖成活率的

5、幾個主要因素進行研究，結果表明:預培養(yǎng)時間1d，蔗糖濃度為0.5mol/L，裝載時間30min，PVS2液處理時間60min組合時莖尖成活率最高，可達50％。同時還比較了其它因子如:莖尖大小、液氮處理時間、化凍方式對成活率的影響，結果表明:切取的0.5～0.8mm莖尖、液氮處理24h以及40℃水浴化凍后的莖尖成活率是比較高的。
　?、汕o尖超低溫脫毒及其效果檢測。以同時帶有SCV，SMoV，SMYEV，SVBV的‘豐香’草莓組培苗為