GhKNL1在棉花(Gossypium hirsutum)纖維發(fā)育中的功能及GhAGP31冷脅迫應(yīng)答研究.pdf

1、棉花是世界上最重要的纖維作物之一。棉纖維是由胚珠外表皮分化而成的高度伸長和增厚的單細胞毛狀突起，是研究細胞的伸長和細胞壁纖維素合成的很好模式材料。在棉纖維發(fā)育過程中，纖維細胞壁發(fā)育通常可分為初生壁和次生壁兩個階段。初生壁階段一系列復(fù)雜的調(diào)控影響棉纖維細胞密度和長度，纖維素合成與次生壁沉積最終影響棉纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，克隆棉纖維次生壁合成相關(guān)基因，研究棉纖維發(fā)育分子機制，對棉纖維品質(zhì)改良具有重要意義。本文從棉花中分離了一個KNOX基因

2、和一個細胞壁蛋白基因，并對這兩個基因的表達模式及功能進行了研究，獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.GhKNL1基因在棉纖維細胞次生壁發(fā)育階段高水平表達
　　 從棉花中分離鑒定了1個Ⅱ類KNOX蛋白基因，命名為GhKNL1。RT-PCR結(jié)果表明，該基因在棉纖維發(fā)育初期和其它組織中表達量較低，隨著棉纖維發(fā)育到次生壁加厚階段，該基因表達量逐漸升高，達到最高值。分離了該基因的啟動子（GhKNL1p）片段，構(gòu)建了PBI-GhKN

3、L1p::GUS融合表達載體，通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行GUS活性染色，結(jié)果顯示GUS信號在擬南芥幼嫩以及成熟組織的維管系統(tǒng)中較強，而在其它組織中基本檢測不到。
　　 利用棉花胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)進一步分析了激素對該基因在棉纖維中表達的影響。結(jié)果表明，ABA、KT和GA對GhKNL1對基因表達沒有顯著影響，以上結(jié)果說明GhKNL1基因可能是纖維次生壁發(fā)育相關(guān)的基因，可能不參與棉纖維次生發(fā)育過程中的激素應(yīng)答。

4、　　 2.GhKNL1蛋白定位于細胞核中
　　 構(gòu)建GhKNL1基因與eGFP的融合表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，激光共聚焦顯微鏡下觀察表明，GhKNL1蛋白定位于細胞核中。
　　 3.GhKNL1蛋白相互作用分析
　　 酵母自激活分析顯示GhKNL1沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。有報道指出，KNOX蛋白通常形成復(fù)合體發(fā)揮功能。為了研究GhKNL1蛋白能否形成同源或者異源二聚體，利用酵母雙雜交系統(tǒng)分析了GhKN

5、L1蛋白相互作用的情況，結(jié)果顯示GhKNL1蛋白可以形成同源二聚體。從棉花中分離了一個OFP基因，命名為GhOFP4，該基因在棉纖維次生壁發(fā)育過程中高水平表達。亞細胞定位結(jié)果顯示GhOFP4蛋白定位于細胞核中，酵母雙雜交證明GhKNL1蛋白能與GhOFP4相互作用。以上結(jié)果表明GhKNL1可能通過形成復(fù)合體的形式參與棉纖維發(fā)育過程。
　　 4.過量表達和顯性抑制GhKNL1導(dǎo)致擬南芥莖中維管束間纖維細胞壁變薄
　　 為了

6、研究該基因?qū)χ参锎紊l(fā)育的影響，我們構(gòu)建了該基因過量表達載體和顯性抑制載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株及其后代株系。選取表達量不同的T2代轉(zhuǎn)基因植株株系進行研究，組織染色和透射電鏡結(jié)果顯示，與野生型相比，過量表達和顯性抑制轉(zhuǎn)基因擬南芥主莖的維管束間纖維細胞壁明顯變薄。RT-PCR結(jié)果顯示，一些次生壁合成基因的表達量顯著下降。同時，GhKNL1過量表達能在一定程度上恢復(fù)擬南芥knat7突變體莖中導(dǎo)管細胞形態(tài)異常以及種子表面粘液形成

7、缺陷的表型。以上結(jié)果說明GhKNL1基因可能負調(diào)控擬南芥莖細胞的次生壁形成。
　　 5.GhKNL1基因的顯性抑制導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉花纖維發(fā)育異常
　　 為了研究GhKNL1在棉纖維發(fā)育中的功能，通過棉花遺傳轉(zhuǎn)化，獲得大量GhKNL1顯性抑制轉(zhuǎn)基因棉花植株。結(jié)果表明，GhKNL1顯性抑制轉(zhuǎn)基因棉花的營養(yǎng)生長過程和野生型差異不大，只是棉桃變小、纖維變短、纖維產(chǎn)量下降。纖維半薄切片分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因棉花胚珠表面纖維細胞的起始滯后

8、，5-20 DPA纖維細胞排列松散、形態(tài)不規(guī)則。與切片結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)基因棉花20 DPA纖維中一些與細胞伸長和次生壁合成相關(guān)基因的表達量明顯降低。以上結(jié)果說明，GhKNL1基因可能在棉纖維伸長和次生壁形成過程中具有重要的調(diào)控作用。
　　 6.GhAGP31基因分離鑒定及功能研究
　　 GhAGP31是一個編碼非典型阿拉伯半乳聚糖蛋白的基因，GhAGP31蛋白包含非典型AGP具有的一些特征結(jié)構(gòu)域:信號肽、N端富含組氨酸的結(jié)

9、構(gòu)域、中間一段富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域和一段具有半胱氨酸的‘PAC’結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位顯示該蛋白定位于細胞壁上。GhAGP31基因主要在根、下胚軸和胚珠中表達量較高。GhAGP31基因的表達量隨著根的發(fā)育有所下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，冷處理會誘導(dǎo)GhAGP31基因在根中的表達。同樣冷處理后，GhAGP31p::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥根中GUS基因的表達顯著上升。GhAGP31基因的過量表達明顯提高了酵母細胞和擬南芥對冷脅迫的耐受性。以上結(jié)果說明GhA