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文檔簡(jiǎn)介
1、棉花是世界上重要的天然纖維作物。棉纖維長(zhǎng)度可達(dá)60mm,成熟纖維長(zhǎng)徑比可達(dá)到1000~3000,其干重的90%以上由纖維素構(gòu)成。所以棉纖維是高等植物中長(zhǎng)徑比最大、纖維素含量最高的單細(xì)胞。因此,棉花是研究細(xì)胞分化、伸長(zhǎng)、以及纖維素合成的理想模型。
棉纖維細(xì)胞發(fā)育經(jīng)歷了4個(gè)連續(xù)的階段:起始、伸長(zhǎng)、次生壁沉積和成熟。在這個(gè)過(guò)程中,纖維細(xì)胞的快速伸長(zhǎng)伴隨著膜脂含量的增加和重構(gòu),對(duì)結(jié)構(gòu)物質(zhì)諸如磷脂、蛋白質(zhì)等需求量很大。
磷脂酶
2、A2(PLA2)催化水解磷脂的sn-2位?;⑴c細(xì)胞膜的重構(gòu)。分泌型磷脂酶A2(sPLA2)是PLA2的一個(gè)亞類。研究表明,sPLA2β在促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)方面起著重要的作用。此外,sPLA2β催化水解的產(chǎn)物溶血磷脂和游離脂肪酸作為信號(hào)分子參與了細(xì)胞發(fā)育調(diào)控。然而,sPLA2在棉花纖維發(fā)育中的作用機(jī)制尚不清楚。因此,有必要對(duì)sPLA2在棉花纖維發(fā)育中的功能作進(jìn)一步的研究。在棉花纖維突起時(shí),檢測(cè)到GhPLA2α亞型編碼基因在纖維細(xì)胞中的表達(dá)水
3、平明顯高于胚珠表皮的非纖維細(xì)胞,推測(cè)該基因參與了棉花纖維細(xì)胞的發(fā)育。進(jìn)而,克隆了sPLA2的兩個(gè)亞型GhPLA2α和GhPLA2β,研究其表達(dá)模式和活性,并在胚珠外表皮中上或下調(diào)目的基因的表達(dá)來(lái)探索它們對(duì)棉纖維細(xì)胞發(fā)育的功能。主要研究結(jié)果如下:
1.磷脂酶抑制劑阻礙纖維伸長(zhǎng)
磷脂酶PLA2抑制劑ONO-RS-082、HELSS和ETYA離體條件下處理-1 dpa的棉花胚珠。觀察纖維發(fā)育的結(jié)果表明,不同濃度抑制劑均對(duì)纖
4、維起始沒(méi)有明顯作用,但隨著抑制劑濃度的增加纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)受到抑制。推測(cè),sPLA2可能主要參與調(diào)節(jié)纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)。
2.GhPLA2α和GhPLA2β的克隆及表達(dá)特性
從棉花cDNA中克隆了sPLA2同源蛋白的編碼基因,分別命名為GhPLA2α和GhPLA2β。Real-time PCR結(jié)果表明,GhPLA2α在8~15dpa的纖維中的表達(dá)豐度最高,暗示GhPLA2α可能參與了纖維伸長(zhǎng)的調(diào)控。相反GhPLA2β主要在
5、葉片和20~23dpa的纖維中有高豐度表達(dá),暗示GhPLA2β可能參與纖維素的沉積。此外,將GhPLA2α的上游調(diào)控序列融合GUS報(bào)告基因構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入番茄。GUS活性分析結(jié)果表明,該上游序列僅在發(fā)育的種子和種皮毛中有活性。
3.離體試驗(yàn)表明,GhPLA2α和GhPLA2β具有催化水解磷脂膽堿的功能
原核表達(dá)系統(tǒng)中,GhPLA2α和GhPLA2β與GST的融合蛋白能夠被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。離體實(shí)驗(yàn)表明,GhPL
6、A2α和GhPLA2β能夠催化水解磷脂膽堿。GC-MS分析甲酯化的水解產(chǎn)物表明,GhPLA2α和GhPLA2β專一性催化水解磷脂膽堿的sn-2位?;?。
4.在胚珠外表皮中上調(diào)和下調(diào)GhPLA2α和GhPLA2β的表達(dá)
為明確GhPLA2α和GhPLA2β在棉花中的作用,利用胚珠表皮特異啟動(dòng)子BAN在棉花中分別上調(diào)和下調(diào)GhPLA2α或GhPLA2β,電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)現(xiàn),纖維在起始階段沒(méi)有明顯變化。但在纖維早
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