GhKNL1和GhMYBL1轉(zhuǎn)錄因子在棉花纖維發(fā)育中的功能研究.pdf

1、棉花作為世界上最重要的自然纖維和油料作物，產(chǎn)區(qū)遍布熱帶和亞熱帶地區(qū)。棉花用途多樣，可應(yīng)用于紡織、食品、造紙等方面，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。而且，由于棉纖維是外表皮單細(xì)胞突起并高度增長加厚的結(jié)果，成熟的棉纖維細(xì)胞壁的纖維素含量高達(dá)95％，這為研究細(xì)胞伸長、纖維素合成以及細(xì)胞壁發(fā)育提供了較為理想的模式系統(tǒng)。棉纖維發(fā)育可以分為起始、伸長、次生壁加厚和脫水成熟四個(gè)階段，起始期影響棉纖維密度，伸長期影響長度，次生壁加厚期影響棉纖維品質(zhì)。我們從研究影響

2、棉纖維次生壁發(fā)育的基因入手，試圖揭示這些基因在棉纖維發(fā)育中的作用機(jī)制，為提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。
　　在本實(shí)驗(yàn)室先前工作的基礎(chǔ)上，本文研究GhKNL1和GhMYBL1兩個(gè)基因在棉纖維發(fā)育過程中的調(diào)控作用。圍繞GhKNL1 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花展開對(duì)GhKNL1功能的進(jìn)一步分析;同時(shí)將對(duì)于GhMYBL1的功能研究從模式植物擬南芥回歸到本體植物棉花中來，結(jié)合一些生化實(shí)驗(yàn)，分析其在棉纖維發(fā)育中發(fā)揮的功能，取得的研究結(jié)果如下:

3、r>　　1、GhKNL1轉(zhuǎn)錄因子在棉纖維發(fā)育過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用
　　為了進(jìn)一步研究GhKNL1基因在棉纖維發(fā)育過程中發(fā)揮的功能，構(gòu)建了該基因的RNA干擾(RNAi)載體，轉(zhuǎn)化棉花，獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株及其后代株系。對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行表型分析，結(jié)果表明，與野生型相比，GhKNL1 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花纖維顯著伸長;去除長絨后，發(fā)現(xiàn)短絨的長度也有較為明顯的增加;脫絨后的種子在大小上有一定程度的變大。由此說明，GhKNL1參與調(diào)控棉纖

4、維發(fā)育過程，可能是作為轉(zhuǎn)錄抑制因子在棉花纖維發(fā)育中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
　　2、GhKNL1調(diào)控一些棉纖維細(xì)胞次生壁相關(guān)基因的表達(dá)
　　提取GhKNL1 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花開花20天后(20 DPA)纖維RNA，利用熒光定量RT-PCR技術(shù)分析棉纖維伸長和次生壁加厚相關(guān)基因的表達(dá)量變化情況。結(jié)果表明，與野生型相比，棉纖維伸長相關(guān)的1，3-β-G基因表達(dá)略有上升，XTH基因表達(dá)量下調(diào)，而一些參與次生壁加厚期的基因表達(dá)量顯著上調(diào)，這

5、說明抑制GhKNL1基因表達(dá)會(huì)影響纖維細(xì)胞次生壁發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)，從而影響棉纖維細(xì)胞次生壁加厚發(fā)育。
　　3、GhMYBL1載體構(gòu)建及棉花轉(zhuǎn)化
　　本實(shí)驗(yàn)室在先前的工作中克隆鑒定了棉花MYB L1基因，并在擬南芥中初步分析了該基因的功能。為了進(jìn)一步研究GhMYBL1在棉纖維發(fā)育中的作用，構(gòu)建了CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhMYBL1過量表達(dá)載體和該基因自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GhMYBL1過表達(dá)載體，GhMYBL1 RNAi載體，

6、以及GhMYBL1與GFP融合表達(dá)載體，用于轉(zhuǎn)化棉花。由于棉花轉(zhuǎn)化效率較低，且需要很長時(shí)間的愈傷組織繼代培養(yǎng)才能產(chǎn)生胚性愈傷組織及再生苗，因此這項(xiàng)工作尚在進(jìn)行中。其中，兩個(gè)GhMYBL1過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化棉花，已獲得轉(zhuǎn)化愈傷組織，經(jīng)過長時(shí)間繼代培養(yǎng)，預(yù)期可能在近期內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織及再生小苗;GhMYBL1∷GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化棉花，已經(jīng)獲得4個(gè)胚性愈傷組織細(xì)胞系，即將出苗;GhMYBL1 RNAi載體轉(zhuǎn)化棉花，獲得12個(gè)胚性愈傷

7、組織細(xì)胞系，其中6個(gè)胚性細(xì)胞系再生出苗。對(duì)所獲得的再生植株進(jìn)行鑒定，在40棵小苗中，有25棵為轉(zhuǎn)基因陽性植株。將這些轉(zhuǎn)基因棉花植株移栽到土中，繼續(xù)生長發(fā)育，部分植株能夠正常發(fā)育，開花結(jié)實(shí)，收獲到T1代種子。將T1代種子萌發(fā)栽種在土中，初步分析了轉(zhuǎn)基因棉花植株表型，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)分析正在進(jìn)行中。
　　4、GhMYBL1影響CelA1啟動(dòng)子和IRX12啟動(dòng)子活性
　　為研究GhMYBL1調(diào)控的基因類型以及調(diào)控方式，進(jìn)行了擬南芥雜交實(shí)

8、驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用的轉(zhuǎn)基因植株為PC1301-CelA1p∷GUS(CelA1啟動(dòng)子與GUS融合)和PC1301-IRX12p∷GUS(IRX12啟動(dòng)子與GUS融合)轉(zhuǎn)基因擬南芥和GhMYBL1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PC1301-CelA1p∷G US轉(zhuǎn)基因擬南芥與GhMYBL1過表達(dá)擬南芥雜交后GUS信號(hào)增強(qiáng)，而PC1301-IRX12p∷GUS與GhMYBL1過表達(dá)擬南芥雜交后GUS信號(hào)變?nèi)酢Ｉ鲜鼋Y(jié)果說明GhMYBL1可以調(diào)控C

9、elA1和IRX12這兩個(gè)啟動(dòng)子的活性。
　　5、GhMYBL1可以在體外直接作用于CelA1啟動(dòng)子的SMRE順式元件
　　為了研究GhMYBL1轉(zhuǎn)錄因子是否能通過對(duì)順式元件SMRE基序的識(shí)別來調(diào)控目的基因表達(dá)，進(jìn)行了凝膠遷移(EMSA)實(shí)驗(yàn)。首先，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)GhMYBL1蛋白，通過純化得到純度較高的GhMYBL1蛋白;再根據(jù)CelA1啟動(dòng)子序列中的SMRE序列設(shè)計(jì)探針，進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，GhMYBL1蛋