轉(zhuǎn)錄因子NAC1在棉花纖維中的表達(dá)及在次生壁發(fā)育中的功能研究.pdf

1、棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,棉花纖維為紡織工業(yè)提供了重要材料來源,因此分離鑒定與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因,研究其表達(dá)模式及其對棉花纖維發(fā)育的調(diào)控機(jī)制,揭示棉纖維生長發(fā)育的分子遺傳基礎(chǔ),對于改善棉花纖維品質(zhì)具有重要的意義。
　　 NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,在各種植物中廣泛存在。NAC家族成員在其N端含有一個保守的大約由150個氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域,C端具有一個高度變異的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。已有的研究表明,NAC蛋

2、白參與了植物的生長發(fā)育和器官的模式建成,在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及非生物損傷和脅迫應(yīng)答過程中,NAC作為轉(zhuǎn)錄因子起激活或抑制應(yīng)答的功能。近幾年的研究報道發(fā)現(xiàn),在擬南芥中許多的NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了莖的次生壁發(fā)育過程,由于棉纖維強(qiáng)度主要由棉纖維次生壁加厚期決定的且其發(fā)育模式與擬南芥中纖維的發(fā)育模式也非常類似,因此篩選與棉纖維次生壁發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,探究其在纖維發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制,對于改善棉花纖維的品質(zhì)具有十分重要的意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室

3、從棉花cDNA文庫中篩選并分離了多個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因(包括GhNAC1-26),其中GhNAC1在棉花纖維中特異表達(dá)且在纖維次生壁加厚期表達(dá)量逐漸上升,而其它的NAC轉(zhuǎn)錄因子則是在各個組織中均有一定量表達(dá)。此外,GhNAC1與擬南芥莖中次生壁發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NST1和NST3有很高的同源性。因此我們對棉花次生壁發(fā)育階段優(yōu)勢表達(dá)的GhNAC1做了重點(diǎn)分析。本文主要從基因結(jié)構(gòu)特征、轉(zhuǎn)錄自激活活性、蛋白亞細(xì)胞定位、以及與次生壁發(fā)育的關(guān)系等

4、方面來研究闡述GhNAC1基因的功能。此外也對其它根優(yōu)勢表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子與脅迫應(yīng)答的關(guān)系進(jìn)行了初步研究。取得如下研究結(jié)果:
　　 1.GhNAC1具有典型的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子的基因結(jié)構(gòu)特征
　　 通過PCR的方法從棉花20dpa fiber cDNA文庫中克隆得到GhNAC1基因的cDNA,并以棉花基因組DNA為模板分離克隆了GhNAC1基因的DNA全長序列。GhNAC1基因的ORF長1152 bp,編碼含有383個

5、氨基酸殘基的蛋白質(zhì),該蛋白N端具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域,包含A,B,C,D,E5個亞結(jié)構(gòu)域,C端具有富含絲氨酸的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。GhNAC1基因全長序列共1346bp,含有3個外顯子和2個內(nèi)含子,其中內(nèi)含子插入的位點(diǎn)均遵守GT-AG規(guī)則,內(nèi)含子1長66bp,其插入位點(diǎn)為編碼第90aa的密碼子內(nèi)部；內(nèi)含子2長128bp,插入在編碼第179aa與第180aa的兩個密碼子之間。該基因的外顯子和內(nèi)含子數(shù)目與其它NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子基因結(jié)構(gòu)非常相似

6、,且其中前兩個外顯子編碼了NAC保守結(jié)構(gòu)域,而第三個外顯子編碼為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。
　　 2.GhNAC1具有轉(zhuǎn)錄自激活活性且自激活區(qū)域位于C端
　　 根據(jù)GhNAC1基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其氨基酸序列的分析,分別構(gòu)建了GhNAC1的PGBKT7-GhNAC1(Full)載體,PGBKT7-GhNAC1(NAC domain)載體,以及PGBKT7-GhNAC1(TAR)載體,轉(zhuǎn)化酵母AH109,分析其是否存在轉(zhuǎn)錄自激活現(xiàn)象。將

7、轉(zhuǎn)化得到的陽性單菌落分別在SD／-Trp和SD／-Trp／-Ade培養(yǎng)基上劃線生長,并進(jìn)行x-gal的顯色反應(yīng),結(jié)果在轉(zhuǎn)入GhNAC1(Full)和GhNAC1(TAR)以后的酵母可以在SD／-Trp和SD／-Trp／-Ade培養(yǎng)基上正常生長,并且在加入x-gal后可以顯藍(lán),而轉(zhuǎn)入對照以及GhNAC1(NAC domain)的只能在SD／-Trp培養(yǎng)基上生長,而不能在SD／-Trp／-Ade培養(yǎng)基上正常生長,且于x-gal反應(yīng)不能顯藍(lán)。

8、從而證明了轉(zhuǎn)入GhNAC1(Full)和IGhNAC1(TAR)的酵母具有轉(zhuǎn)錄自激活的效應(yīng),并且其轉(zhuǎn)錄自激活結(jié)構(gòu)域位于C端即第三個外顯子區(qū)域。
　　 3.GhNAC1蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核利用eGFP作為報告基因研究
　　 植物蛋白的亞細(xì)胞定位是非常成熟且直觀有效的方法。構(gòu)建了GhNAC1與eGFP的融合表達(dá)載體,分析GhNAC1的亞細(xì)胞定位。將GhNAC1-eGFP轉(zhuǎn)化擬南芥后獲得轉(zhuǎn)基因植株,利用激光共聚焦顯微技術(shù),觀

9、察GhNAC1-GFP融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥下胚軸中的定位情況,結(jié)果表明,GhNAC1定位于植物細(xì)胞的細(xì)胞核中。
　　 4.過量表達(dá)GhNAC1轉(zhuǎn)基因擬南芥導(dǎo)致木質(zhì)素的異位積累
　　 為了研究GhNAC1在植物體內(nèi)可能發(fā)揮的功能,分別構(gòu)建了GhNAC1的過量表達(dá)載體pBI121-GhNAC1(Full)和pBI121-GhNAC1(NAC domain)并轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因植株,通過RT-PCR驗(yàn)證其在轉(zhuǎn)基因擬南芥植

10、株中得到了過量表達(dá)。通過與野生型相比較發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)入了pBI121-GhNAC1(Full)的擬南芥葉子明顯向上卷曲,莢果發(fā)育不飽滿,且對其莖的間苯三酚染色結(jié)果顯示,與野生型相比莖的表皮細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯的木質(zhì)素異位積累的現(xiàn)象,同時,RT-PCR的分析表明,轉(zhuǎn)入了pBI121-GhNAC1(Full)的擬南芥與野生型相比,與次生壁發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和次生壁多糖合成的相關(guān)基因的表達(dá)都發(fā)生了明顯的上調(diào)。而過量表達(dá)了GhNAC1(NACdomain

11、)的轉(zhuǎn)基因擬南芥則無此現(xiàn)象,與野生型擬南芥生長情況相似。
　　 5.GhNAC1相互作用蛋白的篩選
　　 為了分析GhNAC1在植物體內(nèi)可能存在的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系,應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),以GhNAC1(NAC domain)為誘餌蛋白,篩選棉花10dpa fiber cDNA文庫。測序結(jié)果顯示篩選得到的蛋白主要可以分為以下幾類,NAC蛋白,E2泛素化酶,核糖體蛋白,周期蛋白,以及一些未知蛋白等。根據(jù)上述結(jié)果,推測其中NAC蛋白

12、可能與GhNAC1轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體發(fā)揮其功能,而E2泛素化酶可能對NAC蛋白功能起到調(diào)節(jié)作用。
　　 6.棉花NAC基因在根中受各種脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 篩選得到了8個在根中優(yōu)勢表達(dá)的GhNAC基因,分別用100μMABA、250mMNaC1、20％PEG和低溫(4℃)處理5天齡棉花的根,分析GhNAC基因的表達(dá)是否受到這些脅迫因子的誘導(dǎo)。Real-time定量RT-PCR結(jié)果表明,GhNAC8,GhNAC10,GhN