楊樹PtrMYB092和PtrMYB152轉(zhuǎn)錄因子在木質(zhì)素合成中的功能研究.pdf

1、木質(zhì)素是植物體內(nèi)含量僅次于纖維素的生物大分子，屬于高分子聚合的芳香醇類物質(zhì)，主要存在于木纖維及管狀分子中。研究發(fā)現(xiàn)，在植物細(xì)胞分化、果實(shí)發(fā)育及抗病過程中，木質(zhì)素均有重要的生理功能。此外，木質(zhì)素也廣泛應(yīng)用于造紙、鑄造、冶煉、化工、橡膠、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，通過解析木質(zhì)素生物合成機(jī)制，將有利于更好地利用資源植物，在生產(chǎn)上具有重大的科學(xué)意義和產(chǎn)業(yè)前景。
　　人們對(duì)植物體內(nèi)生物素合成的途徑已經(jīng)具備了一定的認(rèn)識(shí)。在

2、木質(zhì)素合成途徑中，一系列具有特異催化活性的酶主導(dǎo)了木質(zhì)素的合成。這些直接參與木質(zhì)素合成途徑的因子，其自身的表達(dá)則受到外部環(huán)境和內(nèi)在遺傳因素的雙重控制。其中，MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子具有重要的作用，被認(rèn)為直接或間接的控制了植物的木質(zhì)部發(fā)育和木質(zhì)素含量。
　　楊樹（Populus trichocarpa）是世界范圍內(nèi)種植最廣的速生樹木，是重要的建筑用材和造紙?jiān)?，同時(shí)還可作為生物質(zhì)能源的原料。隨著基因組測序的完成，楊樹已作為木本模式植物廣

3、泛應(yīng)用于木質(zhì)素合成的研究。然而，對(duì)于楊樹中木質(zhì)素合成的調(diào)控機(jī)制，目前還了解的不多。因此，研究楊樹中MYB家族轉(zhuǎn)錄因子對(duì)木質(zhì)素合成途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)的特點(diǎn)和具體機(jī)制，有助于提高我們對(duì)楊樹木質(zhì)素含量和組分決定機(jī)制的認(rèn)識(shí)，幫助我們通過基因工程學(xué)方法改造楊樹品種，得到木質(zhì)素含量和組分有利于生產(chǎn)需求的轉(zhuǎn)基因品系，有著非常重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　在前期生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，我們篩選到兩個(gè)可能參與木質(zhì)素合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子:PtrMYB09

4、2和PtrMYB15。為了闡明它們?cè)跅顦淠举|(zhì)素合成中的功能和機(jī)制，分別進(jìn)行了下述研究:
　　1、克隆楊樹PtrMYB092和PtrMYB15基因并構(gòu)建植物表達(dá)載體。
　　從楊樹基因組中克隆獲得了PtrMYB092和PtrMYB15基因，并測序它們的全長序列。將這兩個(gè)基因的編碼序列、啟動(dòng)子序列分別構(gòu)建在植物表達(dá)載體中，獲得用于轉(zhuǎn)基因超表達(dá)、啟動(dòng)子分析、亞細(xì)胞定位分析和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)的載體，并分別轉(zhuǎn)化植株材料和酵母菌株，獲得了轉(zhuǎn)

5、基因陽性株系。
　　2、PtrMYB092和PtrMYB15在植物木質(zhì)化部位特異表達(dá)。
　　野生型楊樹中，PtrMYB092和PtrMYB15在木質(zhì)部、根、莖、葉柄均有較高的表達(dá)量，雖然不是木質(zhì)部特異性表達(dá)，但仍是富含木質(zhì)素的部位。擬南芥中的啟動(dòng)子分析顯示，較強(qiáng)的GUS活性出現(xiàn)在了莖、葉柄和葉脈中，柱頭、萼片、根也可觀察到藍(lán)色。組織表達(dá)和啟動(dòng)子分析說明，PtrMYB092和PtrMYB15表達(dá)位置跟木質(zhì)素合成的位置重疊。

6、r>　　3、PtrMYB092和PtrMYB152是轉(zhuǎn)錄激活因子。
　　亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示，作為轉(zhuǎn)錄因子，PtrMYB092和PtrMYB152蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。通過酵母單雜交的實(shí)驗(yàn)，證明它們起轉(zhuǎn)錄激活的作用，為激活型的轉(zhuǎn)錄因子。
　　4、PtrMYB092和PtrMYB15激活了木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)。
　　通過熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在PtrMYB092和PtrMYB15超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因楊樹中，部分木質(zhì)素合

7、成相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)量有不同程度變化。其中，多個(gè)木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)被PtrMYB092和PtrMYB152上調(diào)了。
　　5、PtrMYB092和PtrMYB15促進(jìn)了木質(zhì)素的合成和異位沉積。
　　通過一系列組織化學(xué)染色和生化分析檢測，發(fā)現(xiàn)在PtrMYB092和PtrMYB15超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因楊樹中，木質(zhì)素在次生韌皮部發(fā)生了異位沉積，含量顯著提高。與之對(duì)應(yīng)的是，木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞的管壁相比野生型明顯加厚、管