棉花(Gossypium hirsutum)纖維發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及非生物脅迫應(yīng)答研究.pdf

1、棉花不僅是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是紡織工業(yè)的重要原料和戰(zhàn)略物資。棉花纖維細(xì)胞是一種易于分離且較長的植物細(xì)胞，其細(xì)胞次生壁90％以上的成分為纖維素，因此，棉花纖維也被作為一種研究植物細(xì)胞伸長、細(xì)胞壁建成以及纖維素生物合成的模型之一。棉花纖維是由胚珠（種子）外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)分化起始、伸長（初生壁合成）、增厚（次生壁合成）以及脫水成熟等過程發(fā)育而成的單細(xì)胞表皮毛。其中，纖維細(xì)胞的起始決定了最終纖維的數(shù)量，纖維細(xì)胞的伸長決定了成熟細(xì)胞的長度，

2、次生壁合成決定了纖維的強(qiáng)度。因此，克隆棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因并解析其基因產(chǎn)物的功能及分子調(diào)控機(jī)制不僅具有重要的理論意義，而且對提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室從棉花中分離了26個(gè)NAC基因家族成員(cDNA)，分別命名為GhNAC1-26。本文對其中一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子(GhNAC1)在棉纖維次生壁加厚過程中的功能進(jìn)行了研究。此外，本文也對一個(gè)編碼棉花絲裂原活化蛋白激酶的GhMPK17基因進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:

3、>　　1.GhNAC1在棉纖維發(fā)育過程中的表達(dá)分析
　　GhNAC1與擬南芥中NST1、NST2以及SND1(NST3)的同源性較高，且基因結(jié)構(gòu)類似。通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了在下胚軸中具有微弱的表達(dá)外，GhNAC1在棉纖維發(fā)育的次生壁加厚初期優(yōu)勢表達(dá)，且隨著纖維發(fā)育該基因表達(dá)量逐漸升高，至開花后20天其在纖維中的表達(dá)量達(dá)到峰值。GhNAC1啟動(dòng)子表達(dá)模式與其組織表達(dá)情況也較為一致。另外，GhNAC2在伸長和次生壁加厚期

4、的棉纖維中特異表達(dá)，其在纖維中的表達(dá)譜與GhNAC1類似。
　　2.GhNAC1過量表達(dá)對棉纖維次生壁發(fā)育的影響
　　為了探究GhNAC1在棉纖維發(fā)育中的功能，構(gòu)建了GhNAC1過量表達(dá)載體（GhNAC1OE）和RNA干擾(RNAi)載體，轉(zhuǎn)化棉花，獲得大量轉(zhuǎn)基因棉花植株。通過組織切片、觀察統(tǒng)計(jì)、X射線衍射、GC-MS等方法分析發(fā)現(xiàn)，在GhNAC1過量表達(dá)的情況下，棉花葉柄木質(zhì)部細(xì)胞中木質(zhì)素與纖維素含量增多，且在皮層以及髓細(xì)

5、胞中出現(xiàn)了異位沉積的現(xiàn)象，棉纖維長度變短，細(xì)胞壁增厚，纖維素結(jié)晶度增加，不同發(fā)育時(shí)期的棉纖維細(xì)胞壁中的單糖組分含量發(fā)生改變。有關(guān)RNAi轉(zhuǎn)基因棉花的表型及遺傳等方面的分析正在進(jìn)行中。
　　3.GhNAC1轉(zhuǎn)錄因子驗(yàn)證及其互作蛋白分析
　　亞細(xì)胞定位及酵母自激活實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GhNAC1及GhNAC2均屬于轉(zhuǎn)錄因子家族成員。利用酵母雙雜交技術(shù)，以GhNAC1(NAC domain)為“誘餌”，在棉纖維cDNA文庫中篩選互作蛋白。對

6、篩選結(jié)果中感興趣的蛋白重復(fù)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GhNAC1蛋白之間能夠形成同源二聚體，且具有較強(qiáng)的相互作用能力。GhNAC1與GhNAC2以及泛素-蛋白酶體途徑中的E2泛素化接合酶之間也能夠發(fā)生結(jié)合，但它們之間的相互作用較弱。另外，pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)GhNAC1在體外也能夠形成同源二聚體。
　　4.GhNAC1蛋白降解途徑分析
　　文獻(xiàn)報(bào)道，NAC轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯后調(diào)控，其轉(zhuǎn)錄水平的高低主

7、要受到miRNA的控制，而翻譯水平的調(diào)控則依賴于泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解途徑以及某些酶類的修飾來完成。通過觀察不同處理?xiàng)l件下GhNAC1-eGFP轉(zhuǎn)基因擬南芥中的熒光數(shù)量及強(qiáng)度，初步判斷其蛋白的降解與蛋白酶體有關(guān)。RNA、蛋白質(zhì)的半定量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了上述判斷，免疫沉淀的結(jié)果則為GhNAC1蛋白被打上泛素化標(biāo)簽提供了直接的證據(jù)?；谏鲜鲈颍诜g后水平，GhNAC1有可能是通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解的。
　　5.GhNA

8、C1自調(diào)控分析
　　利用35S∷GhNAC1和GhNAC1p∷GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行雜交，對F2代的陽性雜交株以及GhNAC1p∷GUS轉(zhuǎn)基因植株的2周小苗和6周成苗進(jìn)行GUS染色后發(fā)現(xiàn)，無論正交或是反交，在GhNAC1過量表達(dá)的情況下，GUS信號(hào)出現(xiàn)的強(qiáng)度和范圍均有所增強(qiáng)和增大。實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，雜交株中GUS表達(dá)量要高于轉(zhuǎn)基因株系。另外凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(ElectrophoreticMobility Shift Ass

9、ay, EMSA)的結(jié)果顯示GhNAC1能夠結(jié)合在自己的啟動(dòng)子上。上述實(shí)驗(yàn)表明，GhNAC1可能對自身產(chǎn)生一個(gè)正向的調(diào)控作用。
　　6.GhNAC1對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
　　為了研究GhNAC1轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的調(diào)控，分離克隆了12個(gè)可能位于GhNAC1下游的目標(biāo)基因的啟動(dòng)子序列。借鑒以往報(bào)道的擬南芥中能夠與SND1發(fā)生結(jié)合的順式作用元件的基序，利用EMSA技術(shù)，找到了一些受GhNAC1直接調(diào)控的靶標(biāo)基因，這些基因不僅

10、包括上游的轉(zhuǎn)錄因子，而且含有下游參與細(xì)胞壁建成和修飾的功能基因，進(jìn)而總結(jié)出了能夠與GhNAC1發(fā)生結(jié)合的順式作用元件的序列集合——一段具有13個(gè)堿基的不完全回文序列，并對GhNA C1的下游基因，尤其是與纖維素合成相關(guān)的基因在GhNA C1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。RNAi轉(zhuǎn)基因植株中的基因表達(dá)情況以及進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析正在進(jìn)行中。
　　7.GhMPK17基因克隆鑒定及功能研究
　　從棉花cDNA文庫中分

11、離了一個(gè)編碼絲裂原活化蛋白激酶的基因，并將其命名為GhMPK17。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，在NaC1、甘露醇及ABA處理后，GhMPK17在棉花中的表達(dá)量上升。而且，與野生型擬南芥相比，過量表達(dá)GhMPK17的轉(zhuǎn)基因擬南芥在NaCl、甘露醇及外源ABA脅迫的條件下顯示出更高的種子萌發(fā)率、根伸長率和子葉綠葉率，這暗示過量表達(dá)GhMPK17能夠減弱擬南芥對ABA的敏感性，增強(qiáng)植株對鹽和滲透脅迫的抗性。進(jìn)一步研究表明，過量表達(dá)GhMPK17能