棉花(Gossypium hirsutum)JAZ11-D和XND1基因的生物學(xué)功能及調(diào)控研究.pdf

1、棉花是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一，能產(chǎn)生大量的天然紡織纖維。其中，四倍體陸地棉（Gossypium hirsutum）貢獻了全世界約90％的棉花纖維產(chǎn)量。茉莉素(JA)信號通路的抑制因子JAZ(Jasmonate ZIM-domain)蛋白在植物的生長發(fā)育和抗性應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。然而，目前在四倍體陸地棉中很少有關(guān)于JAZ調(diào)控纖維發(fā)育的研究報道。本文分離鑒定了30個非冗余的棉花JAZ基因，研究了它們的表達和互作模式。在此基礎(chǔ)上，對

2、其中一個基因GhJAZ11-D進行了深入研究，以期揭示該基因在棉花纖維伸長發(fā)育中的調(diào)控作用。此外，本文也研究了棉花XND1對植物木質(zhì)部發(fā)育的負調(diào)控作用。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.棉花JAZ家族基因的鑒定、進化關(guān)系和表達模式分析
　　利用已公布的四倍體陸地棉的基因組序列公共數(shù)據(jù)庫，我們鑒定了30個棉花JAZ家族基因，其中15個來自A基因組，15個來自D基因組。進化樹分析表明，棉花JAZ與擬南芥JAZ具有較高的同源性，因

3、此，我們根據(jù)系統(tǒng)命名法把棉花的30個JAZ分別命名為GhJAZ1a-A/D至GhJAZ12-A/D。GhJAZ家族成員可分為5個進化亞枝（Ⅰ至Ⅴ），處于同一進化亞枝的成員都含有相對保守的基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分布。表達分析結(jié)果表明，大多數(shù)棉花JAZ基因都可以受JA誘導(dǎo)，而且不同的JAZ基因在棉花各組織器官和纖維發(fā)育階段的表達存在明顯差異。其中，一些JAZ基因在棉花纖維起始期和伸長期都有較高的表達，暗示著這些GhJAZ基因可能參與調(diào)控棉花纖維的

4、起始和伸長發(fā)育。
　　2.GhJAZ蛋白互作模式分析
　　亞細胞定位實驗表明，所有GhJAZ蛋白都定位在細胞核中。為了進一步闡述GhJAZ在植物體內(nèi)發(fā)揮功能的形式，我們選取了9個GhJAZ蛋白進行酵母雙雜交實驗。結(jié)果表明，GhJAZ1a-A，GhJAZ1b-D、GhJAZ2-D、GhJAZ5-A、GhJAZ11-D和GhJAZ12-D可以與其他大多數(shù)GhJAZ蛋白發(fā)生相互作用，而GhJAZ3-D和GhJAZ7-A只能與1-2

5、個GhJAZ蛋白發(fā)生互作，這說明GhJAZ蛋白在植物體內(nèi)有選擇性地形成同源或異源二聚體，發(fā)揮其功能。此外，大多數(shù)GhJAZ蛋白都可以與JA信號通路的關(guān)鍵因子GhCOI1、GhMYC2、GhMYC3和GhNINJA發(fā)生相互作用。這一結(jié)果暗示GhJAZ蛋白可以與GhMYC2和GhMYC3互作，同時招募GhNINJA，從而抑制JA信號通路;而GhJAZ蛋白可以被SCFCOI1蛋白酶體降解，解除對JA應(yīng)答基因的抑制，激活JA信號通路。
　

6、　3.GhJAZ參與調(diào)控棉花纖維起始
　　選取了10個在纖維起始時期表達量相對較高的GhJAZ基因，研究它們分別在野生型棉花（徐州142）和其無絨無絮突變體(fl)開花當天的胚珠中的表達情況。實驗結(jié)果表明，有8個JAZ基因都表現(xiàn)出相對一致的差異變化趨勢。先前有報道表明，GhMYB2、GhMYB23(與GL1同源）、GhMYB25、GhMYB25-like和GhDEL65（與GL3同源）都可以正調(diào)控棉花纖維細胞的起始。為進一步探索G

7、hJAZ對棉花纖維起始的調(diào)控，檢測了GhJAZ蛋白與這些纖維起始調(diào)控因子之間的互作情況。酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗證實GhJAZ1a-A可以與GhMYB23互作，GhJAZ1b-D可以與GhMYB23和GhMYB25-like互作。以上結(jié)果表明，GhJAZ蛋白可以通過與纖維起始調(diào)控因子相互作用，參與調(diào)控棉花纖維的起始過程。
　　4.GhJAZ11-D促進棉花纖維細胞伸長發(fā)育
　　為詳細研究GhJAZ在棉花纖維發(fā)育中的功能

8、，我們選取GhJAZ11-D基因進行深入研究。構(gòu)建了GhJAZ11-D過量表達(OE)和基因沉默(RNAi)載體，轉(zhuǎn)化棉花，獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株。掃描電鏡的結(jié)果顯示GhJAZ11-D不參與調(diào)控棉花纖維的起始。表型觀察和纖維長度的統(tǒng)計學(xué)分析表明，過量表達GhJAZ11-D轉(zhuǎn)基因棉花株系的纖維長度明顯長于野生型，但GhJAZ11-DRNAi棉花植株的纖維長度沒有明顯變化。纖維品質(zhì)分析表明，過量表達轉(zhuǎn)基因株系的纖維比強度和馬克隆值也發(fā)生了改變。

9、體外胚珠培養(yǎng)實驗也證實GhJAZ11-D促進棉纖維伸長發(fā)育。
　　為揭示GhJAZ11-D促進纖維伸長的機制，以GhJAZ11-D作為誘餌蛋白，篩選棉花纖維的酵母雙雜交cDNA文庫，篩選其互作蛋白。其中，發(fā)現(xiàn)GhEIN3是GhJAZ11-D的互作蛋白之一。此外，與野生型相比，GhJAZ11-D過量表達轉(zhuǎn)基因棉花中乙烯應(yīng)答基因GhERF和GhEXP1的表達量下調(diào)。由于GhJAZ11-D可以與GhEIN3互作，由此推測，植物激素JA和

10、ET可以協(xié)同調(diào)控棉花纖維伸長發(fā)育。
　　5.GhXND1負調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育
　　在棉花中分離鑒定了一個編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的GhXND1基因，序列分析表明GhXND1含有2個內(nèi)含子。GhXND1蛋白定位在細胞核中，具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。hXND1在棉花的子葉、花瓣、根、下胚軸和莖中優(yōu)勢表達，而在其他組織和纖維發(fā)育階段的表達量較低。在擬南芥中異源表達GhXND1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)部維管細胞的數(shù)量相對野生型減少，維管束間纖維的細胞層數(shù)