棉花(Gossypium hirsutum)纖維中木聚糖合成相關(guān)基因的分子鑒定.pdf

1、棉花是世界上重要的纖維作物和油料作物，棉纖維是研究植物細(xì)胞壁發(fā)生和細(xì)胞伸長的理想模型之一。成熟棉纖維含有超過90％的纖維素、少量的半纖維素、果膠和蛋白質(zhì)。關(guān)于細(xì)胞壁組分（特別是半纖維素）在棉纖維發(fā)育中的作用尚未見報(bào)道，半纖維素的改變?nèi)绾斡绊懨蘩w維發(fā)育，如何影響纖維素—半纖維素網(wǎng)絡(luò)而影響纖維品質(zhì)尚知之甚少。本文根據(jù)擬南芥和楊樹中已經(jīng)報(bào)道的參與半纖維素木聚糖合成的蛋白，基于生物信息學(xué)方法從棉花公共EST資料室中分離鑒定了20個(gè)可能參與棉細(xì)胞

2、纖維半纖維素合成的候選基因，對這些基因編碼蛋白的特征進(jìn)行了詳細(xì)分析，并分別選擇了一個(gè)參與主鏈合成和還原末端的候選基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證，主要結(jié)果如下:
　　1.棉花木聚糖合成相關(guān)基因的篩查鑒定及功能預(yù)測
　　通過生物信息學(xué)的方法，基于目前擬南芥和楊樹中木聚糖合成基因的研究，結(jié)合棉花D基因組序列信息，從棉花EST文庫中篩查鑒定了20個(gè)可能參與棉花次生細(xì)胞壁半纖維素合成的基因，并獲得全長cDNA序列。
　　通過蛋白質(zhì)序列對比分

3、析，跨膜結(jié)構(gòu)域分析，信號(hào)肽分析，蛋白定位分析，3D結(jié)構(gòu)分析，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析和進(jìn)化樹等方法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所分離鑒定的候選基因所編碼的蛋白質(zhì)分屬不同的參與木聚糖生物合成的酶家族，其中，有2個(gè)GT47家族的基因，8個(gè)GT8家族的基因，5個(gè)ESK類基因，4個(gè)GXMT類基因和1個(gè)RWA類基因，預(yù)測這些基因可能是定位于高爾基體上的Ⅱ型膜蛋白，并且具有與木聚糖合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，說明這些候選基因可能參與木聚糖的合成。
　　2.木聚糖合成相關(guān)基因

4、在棉花組織中的表達(dá)分析
　　提取棉花不同組織和不同發(fā)育階段棉花纖維的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法對這些基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示這些基因均在棉花纖維中表達(dá)，其中一些基因在棉花纖維次生壁加厚期優(yōu)勢表達(dá)，如GhR WA在棉花纖維次生壁發(fā)育時(shí)期(20DPA)特異性表達(dá)，GhGT47A和GhGT47B在15DPA和20DPA纖維中有較高的表達(dá)量，說明這些基因極有可能參與棉花纖維次生壁合成。

5、r>　　3.GhGT47B基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的功能分析
　　為了證明我們分離的候選基因確實(shí)參與到木聚糖合成，我們分別選擇了一個(gè)參與木聚糖主鏈合成的候選基因GhGT47B，一個(gè)參與木聚糖還原末端合成的候選基因GhGT47A進(jìn)行功能驗(yàn)證，這兩個(gè)基因均在棉纖維發(fā)育的次生壁合成時(shí)期高量表達(dá)。GhGT47B的同源蛋白IRX10在擬南芥中參與木聚糖主鏈合成，其突變體莖具有典型的不規(guī)則木質(zhì)部(irregular xylem，IRX)和木糖含量

6、減少的表型。構(gòu)建了GhGT47B的回補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化irx10突變體，對回補(bǔ)轉(zhuǎn)化苗的8周莖和根的切片分析顯示，與irx10突變體相比，回補(bǔ)植株莖中木質(zhì)部不規(guī)則的程度減輕，但不能完全恢復(fù)到野生型水平，說明GhGT47B與擬南芥IRX10有著類似的功能，但可能有功能歧化。
　　4.GhGT47A/B轉(zhuǎn)基因棉花鑒定分析
　　為研究這GhGT47A/B在棉花纖維發(fā)育中的作用，構(gòu)建GhGT47A/B過量表達(dá)載體和GhGT47A/B RNAi