棉花(Gossypium hirsutum)HOX4的功能及其與PA結(jié)合的調(diào)控研究.pdf

1、棉花作為世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，為紡織業(yè)提供重要的原材料。棉纖維是棉花胚珠表皮細(xì)胞極性伸長發(fā)育而來的一種單細(xì)胞結(jié)構(gòu)的表皮毛，它與擬南芥表皮毛發(fā)育模式相似，AtGL2是調(diào)控?cái)M南芥表皮毛發(fā)育的下游基因，我們在棉花中克隆到4個AtGL2的同源基因，GhHOX1-4，其中GhHOX3已經(jīng)被報(bào)道是參與調(diào)控棉花纖維伸長的一個關(guān)鍵因子。磷脂酸(Phosphatidic Acid, PA)是一種信號分子，被報(bào)道能夠通過與多種靶蛋白結(jié)合來調(diào)節(jié)其活性，

2、能調(diào)控核蛋白的定位和功能。本文圍繞棉花中與AtGL2同源的GhHOX4的功能以及PA與GhHOX4蛋白互作對其功能的調(diào)控進(jìn)行了研究，獲得了如下的結(jié)果:
　　1.pH對PA與GhHOX4蛋白互作的影響
　　PA是一個pH生物感受器，機(jī)體內(nèi)的pH及PA磷酸基頭部的質(zhì)子化會影響PA與靶蛋白的結(jié)合。體外設(shè)置了4個pH條件，通過Lipid-Protein Blotting實(shí)驗(yàn)來研究不同pH條件下PA與GhHOX4蛋白的互作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨

3、著pH的降低，GhHOX4與PA的結(jié)合作用越來越強(qiáng)，這可能說明在植物受到一定環(huán)境脅迫時，體內(nèi)pH的改變會調(diào)節(jié)PA與靶蛋白GhHOX4的結(jié)合，從而影響其發(fā)揮生物學(xué)功能。
　　2.GhHOX4蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域(domain)分析及截短設(shè)計(jì)
　　在我們之前的研究中，發(fā)現(xiàn)PA能夠與GhHOX4蛋白發(fā)生相互作用，為了找到PA與GhHOX4蛋白互作的具體位置，于是我們將GhHOX4蛋白進(jìn)行分段截短。由于GhHOX4是HD-ZIPⅣ家族的

4、一個成員，所以我們就根據(jù)HD-ZIPⅣ家族轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)，將GhHOX4蛋白相應(yīng)的截短成四段:第一段是第97位氨基酸到第155位氨基酸的HD結(jié)構(gòu)域(domain)、第二段是第156到224位氨基酸的ZLZ結(jié)構(gòu)域(domain)、第三段是第297到522位氨基酸的START結(jié)構(gòu)域(domain)、第四段是第523到749位氨基酸的SAD結(jié)構(gòu)域(domain)。
　　3.START結(jié)構(gòu)域(domain)是GhHOX4與PA結(jié)合的關(guān)鍵位

5、點(diǎn)
　　對設(shè)計(jì)的四段截短區(qū)域通過設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，構(gòu)建到原核表達(dá)蛋白載體pET28a或者pMAL上，在大腸桿菌DE3菌株Rosetta中獲得了可溶性的表達(dá)蛋白。通過Lipid-Protein Blotting實(shí)驗(yàn)來分析GhHOX4是通過哪個區(qū)域來與PA進(jìn)行結(jié)合的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA除了能夠與START結(jié)構(gòu)域結(jié)合外，并不與其它三個區(qū)域的蛋白HD、ZLZ、SAD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，說明GhHOX4能與PA結(jié)合的基序是START結(jié)構(gòu)域。
　　4.多

6、堿性氨基酸序列KR-R-R對GhHOX4與PA結(jié)合是必需的
　　在START結(jié)構(gòu)域中找到了可能與PA結(jié)合的多堿性氨基酸序列KR-R-R，分別將這四個氨基酸位點(diǎn)定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔麨镾TARTK339A、STARTR340A、STARTK339A+R340A、STARTR359A、STARTR367A，將它們構(gòu)建到pMAL蛋白表達(dá)載體上，在大腸桿菌DE3菌株中誘導(dǎo)表達(dá)并純化，獲得可溶性的目的蛋白。Lipid-ProteinBlot

7、ting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變后的五個蛋白均不與PA相互作用，說明KR-R-R對GhHOX4蛋白與PA的結(jié)合是必需的。
　　5.PA處理影響GhHOX4轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片表皮毛的起始分化和發(fā)育
　　在體外用PA噴灑處理GhHOX4轉(zhuǎn)基因擬南芥，研究了PA與GhHOX4互作對GhHOX4功能的調(diào)控作用。用20μM PA對生長兩周的GhHOX4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株以及野生型擬南芥進(jìn)行噴灑處理，觀察處理后的擬南芥第五片蓮座葉上的表皮毛，發(fā)現(xiàn)葉片表

8、皮毛數(shù)量減少，四分支表皮毛所占比例也降低，結(jié)合我們之前PA處理GhHOX4過量表達(dá)裂殖酵母使其長度變短的結(jié)果，說明PA與GhHOX4結(jié)合可能抑制GhHOX4的轉(zhuǎn)錄活性，對GhHOX4在棉花纖維發(fā)育中的功能發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
　　6.GhHOX4 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花的初步分析
　　將構(gòu)建的RNAi抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)化棉花，獲得GhHOX4 RNAi轉(zhuǎn)基因棉花植株，通過gDNA水平檢測，鑒定選取陽性轉(zhuǎn)基因棉花小苗種植在大田或溫室中，開