GhACBP4在棉花花藥發(fā)育中的功能鑒定.pdf

1、近年來，全球變暖引發(fā)的區(qū)域性高溫是導(dǎo)致農(nóng)作物雄性不育的重要因素之一，并且嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。研究表明GhCKI在響應(yīng)高溫導(dǎo)致棉花雄性不育方面具有重要功能，因此為了進一步解析高溫脅迫導(dǎo)致棉花雄性不育的敗育機理，通過酵母雙雜篩選出與GhCKI互作的GhACBP4(acyl-CoA-binding protein4)蛋白，并且從超表達GhCKI擬南芥花蕾和棉花H05（高溫敏感型）花藥的磷酸化蛋白質(zhì)組中篩選出3種ACBP4的磷酸化肽段。因此，本研

2、究主要解析GhACBP4在花藥中的功能，主要結(jié)果如下:
　　1、經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)，在陸地棉基因組中GhACBP4存在6個同源基因。組織表達模式分析表明Gh_A13G0893/Gh_D13G1134在花藥中優(yōu)勢表達。然而轉(zhuǎn)基因材料proGh_A13G0893::GUS的組織表達模式表明，該基因在花藥、胚珠和萌發(fā)后的種子中高量表達。而且，高溫誘導(dǎo)表達模式分析表明，在花藥開裂期(ADS，＞24mm花蕾)GhACBP4同源基因總體的表達量

3、受高溫誘導(dǎo)后可能會下調(diào)表達。
　　2、綜合比較6個同源基因的表達水平和3種磷酸化肽段，選取Gh_A13G0893做進一步的功能研究。在超表達Gh_A13G0893和Gh_A13G0893-3'UTR-RNAi特異干涉棉花材料中，都出現(xiàn)了雄性不育的表型。在Gh_A13G0893-3'UTR-RNAi不育材料中GhACBP4的6個同源基因表達量均降低，可能與擬南芥acbp4acbp5突變體敗育表型相一致。借助透射電鏡觀察超表達不育材料

4、的花藥，在絨氈層降解時期，小孢子內(nèi)部缺乏淀粉和脂滴，內(nèi)壁缺失，而且絨氈層中沒有脂滴;在花藥開裂期，花粉外壁沒有含油層。
　　3、相比野生型，超表達GhACBP4不育材料的花藥中脂肪酸含量下降。并且野生型YZ1和H05的花藥中脂肪酸的含量受高溫脅迫后也發(fā)生顯著變化。利用薄層層析發(fā)現(xiàn)，在超表達GhACBP4不育材料的花藥和高溫誘導(dǎo)H05的花藥中，脂質(zhì)的含量也顯著變化。這些結(jié)果表明超表達GhACBP4不育的表型同高溫誘導(dǎo)野生型敗育的表型

5、具有相似性。
　　4、為了驗證GhCKI和GhACBP4是否存在互作，并了解它們發(fā)生互作的位置，通過酵母雙雜、雙分子熒光互補實驗和雙分子熒光素酶互補實驗發(fā)現(xiàn)，GhCKI和GhACBP4存在互作，同時這兩個蛋白共定位于過氧化物酶體中。然而，如果將GhACBP4蛋白的501和517氨基酸位點由絲氨酸(S)突變?yōu)楦拾彼?A)后，含有501位點突變的GhACBP4就不能與GhCKI發(fā)生互作，但含有517位點突變的GhACBP4與GhCKI

6、仍有微弱互作。
　　5、在原核表達過程中發(fā)現(xiàn)，帶有His標(biāo)簽的GhACBP4蛋白可能具有多種磷酸化修飾狀態(tài)，進而無法在體外被GhCKI磷酸化。
　　6、經(jīng)過綜合分析，推測GhACBP4過量表達會激活GhCKI轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致大量GhACBP4蛋白被GhCKI磷酸化;而GhACBP4的活性可能降低，或被降解。當(dāng)GhACBP4轉(zhuǎn)錄水平受到抑制，其蛋白水平也降低。并且，在高溫誘導(dǎo)條件下，這兩種情況可能同時存在。因此，這可能造成過氧化物酶