雙氯芬酸鈉對三種人角膜細胞的凋亡誘導作用研究.pdf

1、雙氯芬酸鈉(Diclofenac Sodium，DFS)是一類重要的眼用非甾體抗炎藥，通過抑制環(huán)氧化酶和脂氧化酶活性減少前列腺素、白三烯等炎性因子的合成和釋放，從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用，同時具有保護血眼屏障的功能。近年來，DFS被廣泛應用于眼科?，F(xiàn)已有文獻報道DFS能抑制成纖維細胞和兔角膜上皮細胞增殖，提示高濃度和長時間用藥可能會損傷正常細胞。目前關于眼科藥物對角膜細胞影響作用的研究主要通過動物實驗和臨床實驗進行，耗資大且耗時多，在很大

2、程度上限制了對眼科藥物的研究范圍和進程。而體外培養(yǎng)的人角膜細胞系作為體外模型進行藥物毒性研究具有均一性好、反應速度快、經(jīng)濟方便等諸多優(yōu)點，使得人角膜細胞系在眼科藥物毒理學研究中的應用越來越廣泛。本文利用實驗室自建的非轉(zhuǎn)染人角膜上皮細胞(HCEPC)、人角膜基質(zhì)細胞(HCSC)和人角膜內(nèi)皮細胞(HCEC)的細胞系作為體外研究體系，研究了DFS對HCEPC、HCSC和HCEC的毒性作用，為了進一步證明其對在體角膜的影響作用，本文以家貓為實驗

3、動物進行了體內(nèi)毒性作用研究，最終根據(jù)體外實驗和體內(nèi)實驗的研究結(jié)果準確評價了DFS對角膜細胞的毒副作用，進一步為DFS的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 為了檢測不同濃度DFS對三種人角膜細胞的影響作用，確定可引起細胞凋亡的有效藥物濃度及其處理時間，本實驗在現(xiàn)有臨床使用濃度(1g/L)的基礎上，倍比降低藥劑濃度至0.03125 g/L，通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)1g/L、0.5 g/L、0.25 g/LDFS在28 h內(nèi)均可引起HCEPC、HC

4、SC和HCEC形態(tài)發(fā)生變化，細胞皺縮變圓直至脫壁死亡，證明DFS在濃度高于0.25g/L時對三種人角膜細胞均具有顯著的細胞毒性。
　　 為了確定不同濃度DFS處理不同時間對三種人角膜細胞的毒性作用，本實驗進行了吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒光雙染色實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCEPC、HCSC和HCEC的凋亡率與DFS的作用濃度和作用時間呈明顯的正相關性。HCEPC經(jīng)1 g/L和0.5 g/L DFS分別處理16 h和24 h后，細胞凋亡

5、率到達100％；0.25 g/L、0.125 g/L，和0.0625 g/L DFS處理HCEPC28 h后的細胞凋亡率分別是27.77％、25.00％和19.76％。1 g/L和0.5 g/LDFS分別處理HCSC8 h和16 h后，細胞凋亡率到達100％；0.25g/L、0.125g/L和0.0625g/L DFS處理HCSC28 h后的細胞凋亡率分別是75.21％、58.76％和26.43％。1g/L、0.5 g/L，和0.25g

6、/L DFS分別處理HCEC8 h、20 h和28 h后，細胞凋亡率到達100％；0.125g/L和0.0625g/LDFS處理HCEC24 h后的細胞凋亡率分別是21.59％和19.64％。實驗結(jié)果證明DFS在濃度高于0.06525 g/L時均能誘導三種人角膜細胞的質(zhì)膜通透性增大，可能DFS的毒性作用是通過誘導人角膜細胞凋亡來實現(xiàn)的。
　　 為了進一步確定DFS對三種人角膜細胞的凋亡誘導作用，本文又利用DNA瓊脂糖凝膠電泳和透

7、射電鏡進行了鑒定。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，經(jīng)0.5g/L和0.25 g/L DFS分別處理16 h和28 h后的HCEPC，經(jīng)0.5g/L和0.25g/L DFS分別處理8 h和24 h后的HCSC，以及經(jīng)1g/L、0.5g/L和0.25g/L DFS分別處理4 h、12 h和20 h后的HCEC，其DNA在瓊脂糖凝膠電泳中均出現(xiàn)了典型的梯狀條帶，即DNA出現(xiàn)了斷片化。然后分別選取0.5g/L DFS處理12 h后的HCEPC、0

8、.25g/L DFS處理20 h后的HCSC和0.5g/L DFS處理12 h后的HCEC，經(jīng)固定、切片后進行了透射電鏡觀察，結(jié)果顯示HCEPC、HCSC、HCEC均出現(xiàn)了染色質(zhì)濃縮且于核內(nèi)呈邊緣化分布、胞質(zhì)空泡化和凋亡小體，證明濃度高于0.25g/L的DFS確能誘導三種人角膜細胞發(fā)生細胞凋亡。
　　 為了驗證DFS對在體角膜細胞的凋亡誘導作用，本文利用DFS處理家貓的角膜細胞進行在體檢測與鑒定。按照臨床用藥劑量滴用DFS滴眼液

9、，持續(xù)用藥2 wk，并利用角膜內(nèi)皮鏡測定了家貓角膜內(nèi)皮細胞的密度、角膜內(nèi)皮細胞平均面積、六角形細胞比率、細胞面積變異率(CV值)等數(shù)據(jù)，跟蹤檢測結(jié)果表明，自滴藥日起20 d內(nèi)，家貓角膜內(nèi)皮細胞密度明顯下降，角膜內(nèi)皮細胞平均面積增大，均與對照眼差異顯著(P<0.01)，CV值上升，六角形細胞比率下降，但與對照眼并無明顯差異(P>0.05)。觀測40 d后對家貓角膜取材，通過茜素紅染色、冰凍切片及HE染色、掃描電鏡和透射電鏡觀察等實驗方法進

10、行了鑒定，茜素紅染色結(jié)果顯示，家貓實驗眼角膜內(nèi)皮細胞密度和六角形細胞比率明顯下降，部分區(qū)域細胞面積變大。HE染色結(jié)果顯示家貓實驗眼角膜基質(zhì)膠原纖維結(jié)構(gòu)變疏松，可能與DFS誘導MMPs的過度表達有關。掃描電鏡結(jié)果顯示家貓實驗眼角膜有少量內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，透射電鏡結(jié)果顯示其角膜上皮細胞細胞間連接被破壞。以上實驗結(jié)果驗證了DFS對家貓角膜細胞的凋亡誘導作用。
　　 本文以非轉(zhuǎn)染HCEP細胞系、HCS細胞系和HCE細胞系作為體外研究體系