新福林和貝特舒對人角膜基質(zhì)細胞凋亡誘導(dǎo)作用的實驗研究.pdf

1、隨著全球人口老齡化進程的加劇，受到青光眼等眼部疾病困擾的患者越來越多，其相應(yīng)的治療藥物在眼科臨床中得到了廣泛應(yīng)用。而眼表直接給藥的方式易導(dǎo)致藥物被角膜吸收而引起角膜損傷，主要是通過作用于角膜細胞引起的。人角膜基質(zhì)細胞（Human corneal stromal cells，HCS細胞）在靠近前彈力層處分布較多，對維持角膜的正常結(jié)構(gòu)和生理功能起關(guān)鍵作用，因此研究眼科藥物對HCS細胞的影響作用對眼科藥物的臨床安全應(yīng)用、低毒藥物篩選體系的建立

2、以及新型無毒眼科藥物的研發(fā)具有重要的應(yīng)用價值和科學(xué)意義。截止到目前，關(guān)于擴瞳用擬腎上腺素藥新福林和治療青光眼用抗腎上腺素藥貝特舒對HCS細胞的毒性作用尚未見報道，本文以本實驗室自建的非轉(zhuǎn)染無致瘤性HCS細胞系為體外研究體系對新福林和貝特舒的凋亡誘導(dǎo)作用及其細胞與分子機理進行研究。
　　為了研究新福林對HCS細胞的毒性影響、凋亡誘導(dǎo)作用及其細胞與分子機理，本文將臨床濃度為100g/L的新福林經(jīng)倍比稀釋至0.78125g/L作用于HC

3、S細胞，通過光鏡觀察、細胞活力和細胞周期檢測觀察其對HCS細胞的影響，光鏡觀察結(jié)果顯示濃度高于0.78125 g/L的新福林可導(dǎo)致HCS細胞出現(xiàn)細胞皺縮、胞質(zhì)空泡化、生長增殖異常等變化并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，細胞活力檢測結(jié)果表明濃度高于1.5625 g/L的新福林均可引起HCS細胞的細胞活力下降，細胞周期檢測結(jié)果表明6.25 g/L的新福林引起HCS細胞發(fā)生S期阻滯，這說明了新福林對HCS細胞具有毒性作用。細胞活力下降和細胞周期受阻均與

4、細胞凋亡有密切聯(lián)系，為了檢測新福林對HCS細胞的毒性作用是否引起HCS細胞的凋亡，本文對其質(zhì)膜通透性變化、磷脂酰絲氨酸外翻、DNA斷片化和超微結(jié)構(gòu)進行了檢測，質(zhì)膜通透性檢測結(jié)果顯示濃度高于3.125 g/L的新福林均對質(zhì)膜通透性產(chǎn)生了顯著影響，6.25 g/L的新福林可導(dǎo)致HCS細胞發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻和DNA斷片化，且伴隨胞質(zhì)空炮化、核固縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體等典型凋亡結(jié)構(gòu)特征出現(xiàn)，說明了新福林對HCS細胞確實具有凋亡誘導(dǎo)作用。細胞

5、凋亡可以通過幾個途徑起作用且有很多凋亡蛋白的參與，為了進一步研究新福林引起HCS細胞凋亡的細胞與分子機理，本文對6.25 g/L新福林處理的HCS細胞進行了Bcl-2家族蛋白的表達、線粒體膜電位和Caspase-3，8，9活性的檢測。Bcl-2家族蛋白的檢測顯示新福林引起HCS細胞促凋亡蛋白Bad和Bax表達升高而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達下降，線粒體膜電位發(fā)生去極化，且Caspase-8，9，3活性先后均增大，揭示新福林通

6、過線粒體途徑和死亡受體途徑共同作用調(diào)控HCS細胞的凋亡。
　　為了研究貝特舒對HCS細胞的毒性影響、凋亡誘導(dǎo)作用及其細胞與分子機理，本文將臨床濃度為2.8 g/L的貝特舒經(jīng)倍比稀釋至0.04375 g/L作用于HCS細胞，光鏡觀察結(jié)果顯示濃度高于0.0875g/L的貝特舒可導(dǎo)致HCS細胞出現(xiàn)細胞皺縮、胞質(zhì)空泡化、生長增殖異常等變化并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，細胞活力檢測結(jié)果表明濃度高于0.0875g/L的貝特舒均可引起HCS細胞的細胞

7、活力下降，細胞周期檢測結(jié)果表明0.7 g/L的貝特舒引起HCS細胞發(fā)生G1期阻滯，這說明了貝特舒對HCS細胞具有毒性作用。進一步研究其凋亡誘導(dǎo)作用，質(zhì)膜通透性檢測結(jié)果顯示濃度高于0.0875 g/L的貝特舒均對質(zhì)膜通透性產(chǎn)生了顯著影響，6.25 g/L的貝特舒可導(dǎo)致HCS細胞發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻和DNA斷片化，且伴隨胞質(zhì)空炮化、核固縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體等典型凋亡結(jié)構(gòu)特征出現(xiàn)，說明了貝特舒對HCS細胞確實具有凋亡誘導(dǎo)作用。Bcl-2家

8、族蛋白的檢測顯示貝特舒引起HCS細胞促凋亡蛋白Bad和Bax表達升高而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達下降，線粒體膜電位發(fā)生去極化，且Caspase-9，3活性先后均增大，揭示貝特舒對HCS細胞的凋亡誘導(dǎo)作用具有線粒體依賴性。
　　綜上所述，在人角膜基質(zhì)細胞系的體系中新福林和貝特舒均具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，且具有濃度和時間依賴性，新福林是通過線粒體途徑和死亡受體途徑的共同作用實現(xiàn)的，貝特舒是通過線粒體途徑實現(xiàn)的。臨床上應(yīng)謹慎