抗菌滴眼液左氧氟沙星和利福平對人角膜內皮細胞的凋亡誘導作用研究.pdf

1、人角膜主要由內皮、基質和上皮及其衍生物等組成，角膜內皮細胞（HCEC）在成年后不具有再生能力，外科創(chuàng)傷或者疾病的治療如青光眼的治療、糖尿病等都會導致內皮細胞數(shù)量的減少，導致視力減弱?？咕窝垡涸谂R床上的使用非常廣泛，主要用來治療角膜炎、結膜炎、沙眼等眼部疾病。本文研究對象左氧氟沙星和利福平是常用的兩種抗菌滴眼液，臨床濃度分別為4.88 g/L和0.5 g/L。左氧氟沙星滴眼液主要用于治療細菌性結膜炎和角膜炎，利福平滴眼液主要用于治療沙眼

2、等眼表炎癥。左氧氟沙星（Levofloxacin）是喹諾酮類抗生素氧氟沙星的左旋體，通過抑制細菌DNA旋轉酶的活性，阻止細菌DNA的合成和復制，最終殺死細菌。利福平（Rifampicin）與細菌的RNA聚合酶結合抑制轉錄，達到抗菌作用?？咕窝垡簩悄な欠翊嬖诙拘宰饔萌找媸艿窖芯空叩年P注。Skelnik指出使用鈣黃綠素熒光標記的方法，測定不同濃度左氧氟沙星溶液培養(yǎng)人角膜內皮（HCE）細胞和基質（HCK）細胞一定時間后的細胞活性，發(fā)現(xiàn)左氧

3、氟沙星對HCE細胞和HCK細胞的毒性具有時間和濃度依賴性（Skelnik等，2003），但未闡明毒性產(chǎn)生的機制。目前利福平滴眼液常見于文獻報道的多為引起嚴重的過敏反應，如丘疹等。本文利用實驗室自建的人角膜內皮（HCE）細胞系作為實驗材料，通過光鏡觀察、AO/EB熒光雙染色、DNA瓊脂糖凝膠電泳和透射電鏡等方法系統(tǒng)研究了左氧氟沙星和利福平對體外培養(yǎng)的HCE細胞的影響作用，并且以家貓為實驗動物進行了體內毒性作用研究，為兩種抗菌滴眼液對HCE

4、細胞的毒性作用的評價提供了實驗依據(jù)。
　　觀察不同濃度左氧氟沙星（0.1525g/L~4.88g/L）處理的HCE細胞，發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)拉伸變長、細胞間連接消失、皺縮變圓、脫壁死亡等形態(tài)變化，說明左氧氟沙星對HCE細胞具有毒性作用。吖啶橙/溴乙錠（AO/EB）熒光雙染色結果顯示，左氧氟沙星能誘導HCE細胞死亡且凋亡率具有濃度和時間依賴性，說明左氧氟沙星能夠顯著提高HCE細胞質膜通透性。DNA瓊脂糖凝膠電泳結果證實左氧氟沙星能夠誘導HC

5、E細胞核DNA發(fā)生斷片化。4.88g/L左氧氟沙星處理12h后HCE細胞的透射電鏡照片結果顯示，細胞出現(xiàn)了結構紊亂、染色質固縮、凋亡小體等細胞凋亡特征。以上實驗結果證明，2.44g/L~4.88g/L的左氧氟沙星能夠誘導體外培養(yǎng)的HCE細胞發(fā)生凋亡。
　　不同濃度利福平（0.03125g/L~0.5g/L）處理的HCE細胞出現(xiàn)了生長停滯、細胞間連接消失、細胞拉伸變長、胞質空泡化形態(tài)學變化，說明利福平對HCE細胞具有毒性作用。吖啶橙

6、/溴乙錠（AO/EB）熒光雙染色結果顯示，利福平能誘導HCE細胞死亡且凋亡率具有濃度和時間依賴性，說明利福平能提高HCE細胞膜的通透性。DNA瓊脂糖凝膠電泳證明利福平能夠誘導HCE細胞核DNA發(fā)生斷片化。0.5g/L利福平處理HCE細胞16h的透射電鏡照片顯示，細胞出現(xiàn)了結構紊亂、染色質固縮邊緣化、凋亡小體等細胞凋亡的超微細胞結構。以上實驗結果證明，0.25g/L~0.5g/L利福平能夠誘導體外培養(yǎng)的HCE細胞發(fā)生凋亡。
　　為了

7、驗證左氧氟沙星與利福平對在體角膜內皮細胞的毒性作用，本實驗利用家貓進行了動物實驗。通過內皮鏡、茜素紅染色和掃描電鏡觀察結果顯示，每天4次結膜下滴入左氧氟沙星或利福平滴眼液，導致家貓角膜內皮部分區(qū)域內皮細胞密度下降、面積增大、非六邊形比例增大、喪失完整細胞結構、細胞皺縮等毒性作用。證明臨床濃度左氧氟沙星和利福平對CCE細胞具有誘導凋亡作用。
　　本文首次利用體外培養(yǎng)的人角膜內皮細胞系證明了左氧氟沙星和利福平對角膜內皮細胞具有顯著的毒