三種TAK1剪接異構體的克隆及其在T細胞中的表達和定位研究.pdf

1、本文通過RT-PCR獲得Jurkat T細胞的總cDNA，然后以其為模板，利用特異引物PCR克隆其中TAKl異構體，從7輪篩選中挑了共180個菌落，有138個陽性菌落，其中鑒定為A的有126個(91.3％)，B有6個(4.35％)，D有6個(4.35％)，但沒有克隆到C異構體。進一步構建了它們的EYFP和Flag標記的融合蛋白表達載體。 其次，利用Western技術檢測了A、B、D三種異構體在293T細胞內的表達情況，發(fā)現所有三

2、種異構體都有兩條大小相差約10KD的特異的蛋白條帶。 然后，利用免疫染色和共聚焦顯微技術研究了EYFP和Flag標記的三種TAKl異構體的融合蛋白在未刺激狀態(tài)下的Jurkat T細胞和293T細胞中的定位，確定了在未刺激狀態(tài)下TAlKl A、B、D三種異構體都是定位在細胞質內的。 最后，結合生物信息學的分析手段，對實驗結果進行了初步分析，推論在TCR信號通路被激活的狀態(tài)下，TAKl A、B、D三種異構體在T細胞內具有不同