沉默TAK1表達對三氧化二砷作用Kasumi-1細胞凋亡的研究.pdf

1、第一部分、CCK-8法檢測As2O3作用kasumi-1細胞株細胞增殖情況
　　目的:篩選出作用于kasumi-1細胞株的最佳As2O3濃度,為后期實驗的藥物作用濃度提供依據(jù)。
　　方法:采用濃度為0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的As2O3分別作用于Kasumi-1細胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h。CCK-8法檢測As

2、2O3作用kasumi-1細胞后細胞的增殖情況,繪制藥物作用后細胞的生長曲線,計算藥物作用的IC50值。
　　結(jié)果:As2O3作用后,細胞增殖抑制率呈濃度依賴性,和時間相關性不大,IC50值為3.5μmol/L。
　　結(jié)論:后期實驗選擇As2O3作用濃度為2μmol/L。
　　第二部分、脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染kasumi-1細胞株轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化及siRNA篩選
　　目的:篩選沉默效果最佳的siRNA。
　　方法:

3、以TAK1作為靶基因,設計出4條siRNA序列,從有無血清、轉(zhuǎn)染時間、脂質(zhì)體劑量、siRNA劑量四個方面優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率。采用實時定量 PCR和Western Blot的方法檢測siRNA作用后,TAK1基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的變化。
　　結(jié)果:TAK1siRNA轉(zhuǎn)染kasumi-1細胞在無血清和有血清時比較,轉(zhuǎn)染效率分別為(75.48±1.07)％和(61.66±0.74)%,P=0.000,差異有統(tǒng)計學意義;siRNA劑量為

4、20pmol, Lipofectamine2000為1.0ul下,轉(zhuǎn)染時間分別為1h、2h、4h、6h、8h、12h時,轉(zhuǎn)染效率分別為(28.37±1.01)%、(47.71±0.93)%、(45.42±1.26)%、(51.68±1.28)%、(52.42±0.91)%、(33.31±1.25)%,6h和8h時,轉(zhuǎn)染效率比較P=0.433,差異無統(tǒng)計學意義。其余各組之間P<0.007,差異有統(tǒng)計學意義;PCR及Western Blot

5、結(jié)果顯示:siRNA3作用組,TAK1在mRNA和蛋白表達上最低。
　　結(jié)論:在無血清、轉(zhuǎn)染6或8小時、脂質(zhì)體劑量/siRNA為20pmol/1μl時,轉(zhuǎn)染效率最高。siRNA3沉默效果最佳。
　　第三部分、封閉TAK1基因?qū)訌娙趸榇賙asumi-1細胞凋亡的實驗研究
　　目的:沉默TAK1表達對As2O3作用Kasumi-1細胞凋亡機制的研究。
　　方法:實驗分4組,未處理組、TAK1siRNA轉(zhuǎn)染組、

6、As2O3處理組、TAK1siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合As2O3組,流式細胞學檢測細胞凋亡率,甲基纖維素半固體培養(yǎng)計算克隆形成率, Western Blot檢測下游蛋白表達量。
　　結(jié)果:As2O3作用kasumi-1細胞后,P-JNK表達增強,在As2O3濃度為2μmol/L,作用30min時,P-JNK表達最強。kasumi-1細胞、TAK1siRNA轉(zhuǎn)染、As2O3作用、TAK1siRNA聯(lián)合 As2O3作用后,細胞凋亡率分別為(5.

7、02±1.13)%、(6.18±0.28)%,(48.33±2.70)%、(86.07±2.21)%,集落形成率分別為(73.83±2.78)%、(76.03±1.46)%、(55.07±1.50)%、(22.20±1.15)%,不同處理條件下凋亡率比較,kasumi-1細胞和TAk1siRNA作用比較P=0.052,其余各組比較P=0.000;不同處理條件下集落形成率比較,kasumi-1細胞和TAk1siRNA作用比較P=0.179