LBH589體外增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL，Apo-2L)是TNF超家族成員之一，通過(guò)與其特異性死亡受體(DR4，DR5)結(jié)合而激活凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)殺傷作用。盡管TRAIL已被證實(shí)能殺傷白血病細(xì)胞而不影響正常宿主細(xì)胞，但某些腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡有耐受性，需要

2、其它化療藥物來(lái)促進(jìn)其對(duì)TRAIL的敏感性，這嚴(yán)重影響TRAIL的臨床應(yīng)用，為治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。因此，尋找能增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的藥物可以提高其臨床應(yīng)用前景。
　　組蛋白的乙?；兔撘阴；谡{(diào)節(jié)基因表達(dá)方面起著重要作用，并且組蛋白脫乙?；?histone deacetylases，HDACs)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyl ases，HATs)的活性與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。組蛋白脫乙?；敢种苿╤isto

3、ne deacetylaseinhibitors，HDACIs）可以抑制組蛋白脫乙?；福龠M(jìn)組蛋白乙?；?，調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出抗增殖、促進(jìn)分化、誘導(dǎo)凋亡等作用。研究表明HDACIs與多種藥物聯(lián)合應(yīng)用，可能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，成為一類新的吸引人的治療AML、ALL及MDS等血液系統(tǒng)疾病的藥物。Panobinostat(LBH589)是一種小分子的HDACIs，為異羥肟酸（氧肟酸）類，能阻斷癌癥和與癌癥發(fā)生有關(guān)的多種病理通路，

4、降低癌細(xì)胞的存活，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。有報(bào)道，LBH589能增強(qiáng)組蛋白H3、H4乙酰化水平和非組蛋白乙?；?，在白血病細(xì)胞中，能減弱信號(hào)蛋白磷酸化，以劑量依賴的形勢(shì)誘導(dǎo)凋亡。
　　急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是臨床常見(jiàn)的一類疾病，其社會(huì)危害大，伴t(8;21)陽(yáng)性AML占全部AML患者的10％-15％，被認(rèn)為是一種預(yù)后良好的類型，但復(fù)發(fā)和耐藥仍然威脅患者長(zhǎng)期生存，接近50％的病人復(fù)發(fā)，且其

5、發(fā)病年齡輕，社會(huì)危害更為顯著。Kasumi-1細(xì)胞是培養(yǎng)自人t(8;21)急性髓系白血病患者的細(xì)胞系，為研究此類白血病的良好模型，本研究旨在探討rsTRAIL聯(lián)合LBH589體外誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡的作用，為此類患者尋找新的治療方法。
　　第一部分 LBH589體外增強(qiáng)rsTAIL誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡
　　目的:觀察rsTRAIL、LBH589在體外單獨(dú)及其聯(lián)合誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡的作用。
　　

6、方法:采用Wright染色法觀察rsTRAIL單藥、LBH589單藥及二者聯(lián)合作用于Kasumi-1細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)改變;采用WST-8(CCK-8)比色法測(cè)定rsTRAIL單藥、LBH589單藥及二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Kasumi-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rsTRAIL單藥、LBH589單藥及二者聯(lián)合作用于Kasumi-1細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果:(1) rsTRAIL和LBH589在體外單用應(yīng)用均可抑制Kasumi

7、-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，10nM和50nM LBH589分別與不同濃度rsTRAIL聯(lián)合用藥可增加對(duì)Kasumi-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，且呈時(shí)間和劑量依賴性(P＜0.05)。
　　(2)rsTRAIL(10ng/mL)和LBH589(50nM)在體外單藥及聯(lián)合作用于Kasumi-1細(xì)胞，AnnexinⅤ陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為(26.03±2.48)％、(24.99±4.11)％及(66.01±7.15)％，與對(duì)照組(7.34±7.15)％相比

8、，差異顯著(P＜0.001)。
　　結(jié)論:LBH589在體外具有增強(qiáng)rsTRAIL誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡的作用。
　　第二部分 LBH589體外增強(qiáng)rsTAIL誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究
　　目的:探討rsTRAIL、LBH589在體外單獨(dú)及其聯(lián)合誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制。
　　方法:采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)不同濃度LBH589作用于Kasumi-1細(xì)胞，經(jīng)不同作用時(shí)間后TRAIL

9、受體DR4、DR5、DcR1及DcR2基因水平變化;Western blot法檢測(cè)rsTRAIL、LBH589單獨(dú)及聯(lián)合作用于Kasumi-1細(xì)胞后，DR4、caspase-3、caspase-9、Bax、Bid及Bcl-2的變化。
　　結(jié)果:(1)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LBH589可以上調(diào)死亡受體DR4的表達(dá)。
　　(2) Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LBH589單獨(dú)及其聯(lián)合rsTRAIL應(yīng)用能上調(diào)DR4的表達(dá)，激