小鼠肝臟細(xì)胞可變剪接模式解析及Tak1蛋白亞型功能研究.pdf

1、可變剪接是Pre-mRNA按不同的剪接方式形成不同成熟mRNA轉(zhuǎn)錄本的過(guò)程。在人類(lèi)中多達(dá)95％的多外顯子基因能夠發(fā)生可變剪接，其對(duì)于蛋白質(zhì)組的多樣性和復(fù)雜性的形成具有重要的貢獻(xiàn)。而肝臟是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最大的代謝器官，由實(shí)質(zhì)細(xì)胞及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、肝星形細(xì)胞及幾種數(shù)量較為稀少的細(xì)胞）組成，各型細(xì)胞間的相互協(xié)作是肝臟發(fā)揮各項(xiàng)生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。因此，能夠同時(shí)關(guān)注多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的組學(xué)研究在揭示肝臟生物學(xué)本質(zhì)時(shí)具有巨大的優(yōu)勢(shì)。<

2、br>　　本課題在前人工作的基礎(chǔ)上，利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)小鼠肝臟四種類(lèi)型細(xì)胞（實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、星形細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面測(cè)序，詳細(xì)論述了各類(lèi)細(xì)胞特異的基因表達(dá)模式及可變剪接模式，探索可變剪接對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控原理，同時(shí)解析了剪接因子與可變剪接事件之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并以Tak1基因的可變剪接為例，論述基因通過(guò)可變剪接這一機(jī)制調(diào)控其蛋白亞型發(fā)揮細(xì)胞特異性功能的具體機(jī)制。
　　本研究在全部四種細(xì)胞中共鑒定到12,947

3、個(gè)基因，其中8,491個(gè)基因（占65.6%）在全部細(xì)胞中均有表達(dá)。GO分析顯示，各細(xì)胞中高表達(dá)的基因富集于細(xì)胞特異性功能相關(guān)的條目上，如實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的高表達(dá)基因主要富集于氧化還原及物質(zhì)代謝的過(guò)程；而在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中，主導(dǎo)細(xì)胞粘附與血管形成的基因呈高表達(dá)狀態(tài)；枯否細(xì)胞中免疫響應(yīng)與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因高表達(dá)；而星形細(xì)胞也顯示出其與與肝臟的纖維化進(jìn)程具有密切的聯(lián)系。我們的數(shù)據(jù)從轉(zhuǎn)錄組的層面上同時(shí)展示了四種細(xì)胞的功能特征，對(duì)蛋白質(zhì)組水平的研究進(jìn)行了極

4、大的補(bǔ)充和完善。值得注意的是，若干代謝相關(guān)的基因（如大分子物質(zhì)代謝相關(guān)等）同樣富集于非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，這是肝臟細(xì)胞間存在代謝協(xié)作過(guò)程的有力證據(jù)。
　　細(xì)胞的可變剪接模式是本研究關(guān)注的重點(diǎn)，我們的數(shù)據(jù)共檢測(cè)到小鼠肝臟細(xì)胞46.2%的多外顯子基因發(fā)生了可變剪接，覆蓋數(shù)據(jù)庫(kù)中已知可變剪接事件總數(shù)的81.5%，證明肝臟內(nèi)存在著較為頻繁的可變剪接調(diào)控。此外，我們的數(shù)據(jù)還鑒定到來(lái)自1,009條基因的1,189次新的可變剪接事件，對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)

5、行了補(bǔ)充。外顯子跳躍是最主要的可變剪接形式，占到全部可變剪接事件的70%以上，但四種細(xì)胞中各類(lèi)型剪接事件的頻率較為相近。編碼調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄因子及蛋白激酶的基因受可變剪接調(diào)控的比例最高，這可能是可變剪接能夠造成下游廣泛生物學(xué)改變的原因所在。從細(xì)胞的功能特征上看，發(fā)生可變剪接的基因顯著富集于細(xì)胞的主體功能上：實(shí)質(zhì)細(xì)胞專(zhuān)職于某一代謝功能的完成，而非實(shí)質(zhì)細(xì)胞除完成各自細(xì)胞特異的功能外，還承擔(dān)了對(duì)各類(lèi)代謝功能進(jìn)行調(diào)控的任務(wù)，如富集于“Positi

6、ve Regulation of Metabolic Process”等條目上，表明可變剪接是一種在轉(zhuǎn)錄調(diào)控基礎(chǔ)上的更加精細(xì)的功能調(diào)控方式，是細(xì)胞特異性形成的重要原因。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中具有最多數(shù)量的可變剪接事件，這可能與其特殊的解剖位置、生理功能及與其它細(xì)胞間存在大量的Crosstalk有關(guān)。
　　我們進(jìn)一步鑒定并驗(yàn)證了四種細(xì)胞中的細(xì)胞特異性外顯子，發(fā)現(xiàn)包含有細(xì)胞特異性外顯子的基因與細(xì)胞的核心功能密切相關(guān)，其可變剪接模式主導(dǎo)了細(xì)胞間

7、功能差異的形成；從整體的層面上看，細(xì)胞特異性外顯子并不傾向于富集在具有明確功能的蛋白核心結(jié)構(gòu)域上，而是大量位于無(wú)序結(jié)構(gòu)中。肽段形成的無(wú)序結(jié)構(gòu)往往對(duì)蛋白間的相互作用有較大影響，而眾多包含有細(xì)胞特異性外顯子的無(wú)序結(jié)構(gòu)也確實(shí)形成了蛋白間的結(jié)合區(qū)域，因此，通過(guò)影響蛋白間的相互作用可能是可變剪接影響蛋白功能的主要途徑。此外，細(xì)胞特異性外顯子對(duì)應(yīng)的肽段中還包含有更多的翻譯后修飾位點(diǎn)，這也可能是可變剪接造成功能改變的途徑之一。
　　剪接因子是可

8、變剪接的上游調(diào)控者，對(duì)細(xì)胞特異性可變剪接模式的形成起到?jīng)Q定性的作用。我們篩選了各細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá)的剪接因子，如實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的Esrp2與枯否細(xì)胞中的Srsf9等。GO分析發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞特異性剪接因子能夠調(diào)控大多數(shù)的細(xì)胞特異性可變剪接事件，其靶基因與各自類(lèi)型細(xì)胞的核心功能關(guān)系密切。為全面闡述剪接因子的調(diào)控規(guī)律，我們構(gòu)建了小鼠肝臟細(xì)胞背景下的“Splicing Map”，重點(diǎn)展現(xiàn)剪接因子與可變外顯子之間復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，總結(jié)了剪接因子類(lèi)型、細(xì)胞種

9、類(lèi)、motif位置等諸多因素對(duì)最終調(diào)控效應(yīng)的影響。值得注意的是，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中擁有最多數(shù)量的可變剪接事件，同時(shí)也富集到了最多的剪接因子對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，表明肝竇內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存在著活躍的剪接調(diào)控過(guò)程，提示可變剪接對(duì)細(xì)胞功能調(diào)控及對(duì)細(xì)胞特性形成具有重要的作用。
　　可變剪接的功能最終仍然需要分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的確證，因此，我們以Tak1基因?yàn)槔?，論述可變剪接如何?duì)蛋白亞型的細(xì)胞特異性功能進(jìn)行調(diào)控。Tak1存在兩個(gè)常見(jiàn)亞型，Tak1-B存在于實(shí)質(zhì)

10、細(xì)胞中，而三種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中則以Tak1-A亞型為主。Tak1-A的功能主要富集于免疫相關(guān)的條目中，而Tak1-B則與基礎(chǔ)的氨基酸合成及脂質(zhì)代謝等過(guò)程關(guān)系密切。Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示，Tak1-A更容易與Tab2結(jié)合，同時(shí)其下游的JNK、p38及NF-κB通路的磷酸化程度更高。JNK、p38通路與細(xì)胞內(nèi)的免疫及炎癥過(guò)程密切相關(guān)，這與Tak1-A在非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的分布及功能相符。同時(shí)，將Tak1-B轉(zhuǎn)換為T(mén)ak1-A后，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的若干基因的

11、表達(dá)也發(fā)生顯著變化，表明Tak1-A失去了Tak1-B對(duì)脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)控作用。另外，異常的免疫應(yīng)激狀態(tài)與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，而我們同樣在臨床肝癌樣本中檢測(cè)到了 Tak1-A比例的異常升高，但這一可變剪接事件是否確實(shí)影響肝癌的發(fā)生尚未能確定，其具體機(jī)制也需要進(jìn)一步的深入研究。
　　綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)小鼠肝臟四種類(lèi)型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總結(jié)并詳細(xì)討論了細(xì)胞類(lèi)型特異的基因表達(dá)模式及可變剪接模式，認(rèn)為可變剪接的整體調(diào)控是肝臟細(xì)胞間功能

12、特異性形成的重要原因，是一種相較于轉(zhuǎn)錄調(diào)控及蛋白表達(dá)調(diào)控的更加精準(zhǔn)的調(diào)控方式，揭示了小鼠肝臟細(xì)胞構(gòu)成的生物學(xué)原理。細(xì)胞特異的可變剪接事件決定細(xì)胞的核心功能，這主要是通過(guò)影響蛋白間的相互作用及翻譯后修飾而實(shí)現(xiàn)的。剪接因子的調(diào)控對(duì)細(xì)胞特異性可變剪接模式的形成至關(guān)重要，其間包含了剪接因子種類(lèi)、motif位置、細(xì)胞類(lèi)型等多種影響因素，是細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境綜合作用的結(jié)果。最終，我們以Tak1基因?yàn)槔?，詳?xì)闡述了可變剪接調(diào)控蛋白亞型功能以適應(yīng)不同類(lèi)型細(xì)胞