HuR通過拮抗內(nèi)含子中嘧啶富集區(qū)的作用調(diào)節(jié)WT1+--KTS亞型的可變剪接.pdf

1、目的:可變剪接是人體蛋白功能多樣性的重要來源，人類基因組中超過90％的編碼基因表達都存在可變剪接現(xiàn)象?？勺兗艚油蒻RNA前體中剪接調(diào)控元件與特異的RNA結(jié)合蛋白相互作用進行調(diào)控。根據(jù)其位置及其作用，可將剪接調(diào)控元件分為外顯子或內(nèi)含子中的剪接增強子或沉默子。之前的研究表明，剪接增強子能夠招募SR蛋白而剪接沉默子則更易招募hnRNPs等反式作用因子，抑制或激活對剪接位點的識別。
　　Wilms'tumor1(WT1)基因位于11q

2、13，一共有10個外顯子，編碼的蛋白分子量為52-54kD，在C末端含有四個鋅指功能區(qū)。WT1基因表達中有兩個主要可變剪接事件，其中+KTS和-KTS是由于第九外顯子末端存在兩個可變5’剪接位點而導致在WT1蛋白的第三和第四鋅指結(jié)構(gòu)之間插入或缺失三個氨基酸KTS。+/-KTS在蛋白序列上僅相差3個氨基酸，在功能上既有很多相似之處，但又有各自獨特的功能。這兩種亞型在心臟、脾臟、腎上腺的發(fā)育中具有相似作用，而在腎臟發(fā)育，性別分化等過程中發(fā)揮

3、不同作用。
　　研究表明，-KTS亞型的主要功能是作為轉(zhuǎn)錄因子，而+KTS亞型主要參與轉(zhuǎn)錄后的RNA加工過程。與這兩種蛋白亞型的不同功能相對應(yīng)的是它們在細胞核中的分布也不同，-KTS亞型在核中呈現(xiàn)較為均勻的分布，而+KTS亞型則主要分布在與RNA剪接功能相關(guān)的核斑區(qū)。進一步研究表明在乳腺上皮細胞中WT1-KTS亞型起著腫瘤抑制作用，它能使p21表達上升，并導致細胞增殖減緩，細胞周期停滯在G2期;而+KTS亞型表現(xiàn)出促進腫瘤進程的功

4、能，它對p21的表達和增殖沒有明顯影響，但導致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)并伴隨著E-caderin和vimentin的表達變化。
　　然而，+KTS和-KTS可變剪接的調(diào)控機制尚不清楚，本研究的目的在于對WT1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制進行深入研究，并初步探討+KTS和-KTS亞型發(fā)揮不同作用的機理，為轉(zhuǎn)化醫(yī)學提供進一步的理論依據(jù)。
　　方法:(1)建立分離WT1+/-KTS亞型的方法。從Hela和293T細胞中提取總RNA，并利用RT

5、-PCR技術(shù)檢測細胞內(nèi)源性WT1+/-KTS亞型的表達量。(2)定位并驗證順式作用元件對+/-KTS亞型可變剪接的調(diào)控作用。主要采用序列刪除來定位調(diào)控+/-KTS可變剪接的順式作用元件，順式元件定位后用序列替換進一步驗證順式元件對可變剪接的調(diào)控作用。(3)純化并鑒定調(diào)控可變剪接的反式作用因了。利用Biotin-streptavidin親和純化技術(shù)純化+KTS和-KTS亞型特異蛋白復(fù)合物并通過質(zhì)譜分析得出其主要組分。通過RNA RIP實驗

6、進一步驗證反式作用因子與順式作用元件有相互作用。(4)在報告基因水平上篩選并驗證反式作用因子對+/-KTS可變剪接的調(diào)控作用?？寺『蜻x反式作用因子，利用瞬時共轉(zhuǎn)染技術(shù)將候選基因和WT1報告基因轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中，利用RT-PCR檢測不同亞型的相對表達量，篩選出對+/-KTS可變剪接有明顯調(diào)控作用的剪接因子HuR。(5)在細胞內(nèi)源性表達水平上進行驗證反式作用因子對+/-KTS可變剪接的調(diào)控作用。構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)表達HuR的細胞株，用RT-PCR

7、檢測反式作用因子HuR在表達升高時是否能影響細胞內(nèi)源性WT1+/-KTS亞型的表達。(6)利用RNAi技術(shù)敲低細胞中HuR的表達，檢測細胞內(nèi)源性WT1+/-KTS亞型的表達。
　　結(jié)果:(1)WT1第九內(nèi)含子中的一段嘧啶富集區(qū)對于+KTS亞型的表達至關(guān)重要，刪除這一序列導致-KTS的比例從29％上升到93％。(2)這段嘧啶富集序列與多種剪接因子相互作用。(3)HuR與這段嘧啶富集序列相互作用并在報告基因水平促進-KTS亞型的產(chǎn)生。

8、(4)過表達HuR促進-KTS亞型的內(nèi)源性表達。(5)敲低HuR抑制-KTS亞型的內(nèi)源性表達。
　　結(jié)論:本研究中，我們通過刪除或部分替換WT1第9內(nèi)含子中的一段富含嘧啶區(qū)域Tn發(fā)現(xiàn)-KTS亞型表達升高，表明其對+KTS亞型的產(chǎn)生具有重要作用。利用親和純化結(jié)合質(zhì)譜分析得出許多結(jié)合于這一序列上的剪接因子。在報告基因和細胞內(nèi)源性表達雙重水平上驗證，HuR是能夠促進-KTS亞型表達的反式作用因子。研究表明，HuR通過結(jié)合并拮抗WT1第九