三氧化二砷誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制——線粒體在凋亡中的作用及凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化的基因芯片研究.pdf

1、急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，病因尚不完全清楚，主要病變?yōu)楣撬柚械脑缬琢＜?xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在早幼粒階段。三氧化二砷(Arsenic trioxide，As<,2>O<,3>)用于臨床治療APL已有許多成功的范例，并已成為臨床治療APL的有效措施。研究表明，砷劑作用的重要機(jī)制就是它能有效地誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡。目前的研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞核基

2、因組表達(dá)基因的改變參與了As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的APL細(xì)胞凋亡過程。利用基因芯片技術(shù)對(duì)As<,2>O<,3>誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡過程中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的報(bào)告鮮見。有資料顯示一些作用于線粒體外膜的基因表達(dá)參與了As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控，且線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用。但線粒體基因組在該過程中是否表達(dá)，線粒體基因組在細(xì)胞凋亡中的作用及地位目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此探討As<,2>O<,3>誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋

3、亡過程中線粒體基因組的表達(dá)對(duì)于進(jìn)一步闡明As<,2>O<,3>的作用機(jī)制具有重要的意義。 本課題采用熒光顯微鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞儀、DNA Ladder、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)、線粒體膜電位檢測(cè)、RT-PCR等方法，研究As<,2>O<,3>對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡、生長(zhǎng)抑制作用；設(shè)計(jì)線粒體基因組引物，在基因及蛋白質(zhì)水平對(duì)線粒體基因組在該過程中的差異表達(dá)進(jìn)行研究；利用基因芯片技術(shù)對(duì)1384個(gè)凋亡相關(guān)基因在As<,2>O<,3>誘導(dǎo)AP

4、L細(xì)胞凋亡過程中的表達(dá)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探討As<,2>O<,3>誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供有力線索，為As<,2>O<,3>在APL及惡性腫瘤中的應(yīng)用提供依據(jù)。主要的研究結(jié)果如下： 1．NB4細(xì)胞經(jīng)As<,2>O<,3>誘導(dǎo)凋亡后呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變。熒光顯微鏡顯示NB4細(xì)胞經(jīng)As<,2>O<,3>處理48h后出現(xiàn)細(xì)胞核致密濃染、染色質(zhì)固縮及片斷化斷裂，甚至呈碎片狀。透視電鏡顯示細(xì)胞核皺縮，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)邊集。對(duì)照細(xì)

5、胞未見形態(tài)學(xué)改變。 2．As<,2>O<,3>對(duì)NB4細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。As<,2>O<,3>作用于NB4細(xì)胞后，在一定的濃度范圍內(nèi)(0.5umol/L-8umol/L)，在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著As<,2>O<,3>濃度的升高，其對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，生長(zhǎng)抑制曲線呈“S”型改變，具有明顯的量-效效應(yīng)；而同一濃度的As<,2>O<,3>，其對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，具有明顯的時(shí)一效效應(yīng)。給

6、予8umol/L As<,2>O<,3>處理NB4細(xì)胞后其生長(zhǎng)抑制率于24h、48h、72h分別達(dá)到78.8％、91.2％和100％。 3．流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)NB4細(xì)胞經(jīng)0.5umol/L、1umol/L、2umol/L、3umol/LAs<,2>O<,3>其細(xì)胞凋亡率分別為5.02％、6.40％、28.40％、33.34％。As<,2>O<,3>濃度越高，NB4細(xì)胞凋亡率越高，二者之間具有一定的量效關(guān)系。 4．以0.

7、5umol/L、1umol/L、2umol/L、4umol/L、8umol/L As<,2>O<,3>分別處理NB4細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)NB4細(xì)胞線粒體膜電位分別下降12.8％、21.6％、66.9％、83.7％、83.8％。 5．RT-PCR對(duì)As<,2>O<,3>誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡過程中的13個(gè)線粒體基因組基因進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)COX2在As<,2>O<,3>誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡過程表達(dá)下調(diào)，其余12個(gè)基因表達(dá)無明顯改變，W

8、estern Blot分析顯示COX2在蛋白質(zhì)水平表達(dá)呈降調(diào)節(jié)。 6．通過對(duì)1384個(gè)凋亡相關(guān)基因的mRNA制備的寡核苷酸芯片的研究發(fā)現(xiàn)，NB4經(jīng)2umol/LAs<,2>O<,3>誘導(dǎo)凋亡后有16個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)，其中MT2A、SST、NFAT5、SERPINB5等4個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，EIF4G2、FDXR、CCT5、TFDP1、PRG1、P2RY6、MPO、ANP32A、CEPBA、HLA-B、YWHAE、TXNDC5等12

9、個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，選取其中改變最顯著的4個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。 結(jié)論： 1、As<,2>O<,3>在體外具有顯著的誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞(NB4細(xì)胞)凋亡及生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，這種效應(yīng)在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出量效及時(shí)效關(guān)系。 2、As<,2>O<,3>誘導(dǎo)NB4細(xì)胞的凋亡作用與線粒體的膜電位下降密切相關(guān)，隨著細(xì)胞凋亡率的提高，線粒體膜電位呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。 3、線粒體相關(guān)基因COX2的表

10、達(dá)變化可能參與了As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡過程。 4、在As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡過程中，MT2A、SST、NFAT5、SERPINB5等4個(gè)基因表達(dá)的升調(diào)節(jié)及EIF4G2、FDXR、CCT5、TFDP1、PRG1、P2RY6、MPO、ANP32A、CEPBA、HLA B、YWHAE、TXNDC5等12個(gè)基因表達(dá)的降調(diào)節(jié)可能參與了這一過程，上述基因表達(dá)的變化與As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞