三氧化二砷對前列腺癌DU145細胞中KEAP1基因表達作用研究.pdf

1、背景和目的
　　前列腺癌是在男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。目前治療前列腺癌的主要方法有手術，激素拮抗治療，化療和放療。雖然大多數(shù)前列腺癌患者最初的雄激素去勢有效，但他們通常會在數(shù)月至數(shù)年后出現(xiàn)在雄激素非依賴性。雄激素非依賴性的前列腺癌的預后比較差，且多對化療和放射治療不敏感。目前激素非依賴型前列腺癌對放、化療抵抗的機制目前還不明確。因此了解腫瘤細胞如何產生耐藥及如何才能逆轉耐藥是急需解決的重要問題。
　　近幾年來已

2、有多項試驗證實KEAP1-NRF2-ARE信號通路與多重耐藥機制相關聯(lián)[1，2]，目前已經在NSCL、乳腺癌、結腸癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)KEAP1基因的突變，使表達相關蛋白下降且NRF2相關蛋白高表達[3，4]，已有實驗證實在非小細胞肺癌，結腸癌，前列腺癌DU145細胞中KEAP1基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化而低表達[5，6]，前列腺癌PC3細胞中KEAP1基因高表達，所以本實驗選擇PC3細胞做為陽性對照[7]。我國學者將三氧化二砷用于治療

3、急性早幼粒細胞白血病取得顯著療效，引起了普遍關注;隨后證實其對實體瘤也能獲得同樣效果，同時三氧化二砷的去甲基化作用也有報道。本研究通過用不同濃度As2O3溶液對前列腺癌DU145細胞進行處理，檢測藥物對細胞增殖抑制影響及對細胞中KEAP1基因表達的影響，初步探索As2O3對KEAP1基因可能的作用機制，從而為激素非依賴性前列腺癌的治療提供新的治療藥物。
　　材料和方法
　　1.雄激素非依賴性前列腺癌DU145細胞，用10％滅

4、活胎牛血清含雙抗的新鮮DMEM-H培養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)箱中(T:37℃，5％CO2)常規(guī)培養(yǎng);PC-3細胞用含10％滅活胎牛血清的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。
　　2.應用MTT法檢測不同濃度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0μmol/L)的As2O3不同作用時間(24、48、72h)對DU145細胞的生長抑制作用。
　　3.應用RT-PCR方法檢測不同濃度（0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L

5、）As2O3作用于各組DU145細胞72h后KEAP1基因mRNA表達情況。
　　4.應用Westernblot方法檢測不同濃度組(0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)As2O3的作用激素非依賴性前列腺癌DU145細胞株72h后KEAP1蛋白表達的情況，PC3細胞組作為對照組。
　　5.統(tǒng)計學處理:實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，各組數(shù)據(jù)間采用非參數(shù)檢驗、t檢驗及方差分析進行差異比較，檢驗水準α=

6、0.05。
　　結果
　　1.MTT結果顯示:隨著As2O3濃度的升高對DU145細胞抑制作用越明顯，在8.0μmol/L時抑制率最高;根據(jù)不同時間點對抑制率的測定在72h時抑制率最高。因此As2O3對DU145細胞的抑制作用具有劑量依賴性和時間依賴性。
　　2.RT-PCR結果顯示:在不含As2O3的處理組中，前列腺癌DU145細胞的KEAP1基因mRNA表達不明顯，經As2O3處理72h后，KEAP1基因表達逐漸增

7、強，在2.0μmol/L時條帶亮度最大，表達最強。
　　3.Westernblot結果顯示:陰性對照組keap1蛋白未表達;不同濃度As2O3處理人前列腺癌DU145細胞72h后，各濃度組KEAP1蛋白均出現(xiàn)表達;2.0μmol/LAs2O3處理組與陽性對照PC-3組顯示的KEAP1蛋白條帶最深。
　　結論
　　1.As2O3對前列腺癌DU145細胞的增殖具有抑制作用，并且隨著劑量的增大或時間的增長抑制作用而逐漸增強，