靶向SPK1的RNA干擾對前列腺癌細胞Du145的影響.pdf

1、前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來我國前列腺癌發(fā)病率逐漸上升，前列腺癌目前多采用雄激素全阻斷為主的內(nèi)分泌治療，但多數(shù)病人在經(jīng)過內(nèi)分泌治療后，常常轉(zhuǎn)為非雄激素依賴性，成為激素難治性前列腺癌，出現(xiàn)復發(fā)或多發(fā)轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的手術、放療、化療和激素療法對激素難治性前列腺癌治療效果不佳，目前國內(nèi)外許多學者都在探求基因水平的調(diào)控方法和尋找治療的新靶點，以期在前列腺癌的治療上取得突破。 近年研究證明細胞膜鞘磷脂的衍生物包括神經(jīng)酰胺(

2、Cer)、鞘氨醇(Sp)、1-磷酸鞘氨醇(S1P)等多種代謝產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡中起著關鍵的作用。而鞘氨醇激酶(SPK)是維持細胞內(nèi)上述物質(zhì)平衡的重要限速酶，也是細胞增殖及存活的重要調(diào)控因子。鞘氨醇激酶信號通路與細胞的凋亡、生長、增殖密切相關，SPK1是其主要功能酶。Cer和Sp是細胞增殖的負調(diào)控因子，能夠抑制細胞生長、促進細胞凋亡，S1P則刺激細胞生長、抑制細胞凋亡。SPK1磷酸化Sp生成S1P，S1P通過細胞內(nèi)外作用

3、機制調(diào)節(jié)細胞生長和凋亡。對SPK1進行調(diào)控，將影響細胞內(nèi)Cer、Sp、S1P的水平，細胞內(nèi)Cer、Sp、S1P的水平的高低，將影響細胞的生長、增殖和凋亡。 RNA干涉(RNAi)是近期發(fā)展起來的一種新的基因治療和診斷技術，RNA干涉是指在多種生物細胞內(nèi)，由雙鏈RNA介導同源序列mRNA的特異性降解，從而導致基因沉默的現(xiàn)象。我們設想通過RNA干涉的方法，導致SPK1基因沉默，進而抑制SPK1的表達，調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、1-磷酸

4、鞘氨醇在細胞內(nèi)的水平，誘導非激素依賴性前列腺癌細胞的凋亡，以探討對非激素依賴性前列腺癌細胞的基因治療。 目的：通過檢測SPK1信號分子在非激素依賴性前列腺癌細胞Du145中的表達情況，以及評價重組腺病毒Ad-H1-SPK1介導，RNA干涉Du145細胞SPK1基因，對SPK1和抗凋亡蛋白Mcl-1表達的影響；探討重組腺病毒Ad-H1-SPK1介導，干涉SPK1對細胞凋亡的作用及可能的機制，為非激素依賴性前列腺癌細胞的基因治療尋找

5、新的靶點。 方法：我們選擇非激素依賴性前列腺癌細胞株Du145，作為我們的實驗研究對象；構(gòu)建并制備了攜帶SPK1特異干涉序列的重組腺病毒Ad-H1-SPK1，作為介導對SPK1基因進行RNA干涉的研究工具；我們利用RT-PCR的方法，檢測Du145細胞株中SPK1信號分子的表達；用腺病毒Ad-GFP作為參照，用不同滴度的腺病毒對Du145細胞進行感染，檢測腺病毒對Du145的感染效率；我們用Ad-H1-SPK1感染Du-145細

6、胞，并以不含SPK1特異干涉序列腺病毒Ad-H1作為對照，Western blot檢測SPK1的表達，并用Western blot檢測重要抗凋亡蛋白Mcl-1的表達，評價干涉SPK1對SPK1、Mcl-1蛋白表達的影響；用MTT的方法檢測干涉SPK1，對阿霉素抑制前列腺癌細胞Du-145增殖的影響；用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況，評價干涉SPK1對喜樹堿誘導Du-145細胞凋亡的影響。 結(jié)果：我們用RT-PCR的方法，在非激素依

7、賴性前列腺癌細胞株Du-145中檢測到了SPK1信號分子的表達；我們測定腺病毒對Du-145細胞的感染效率為99.92％(MOI=100)，完全可以滿足后續(xù)實驗的要求；用Ad-H1-SPK1感染Du-145細胞，介導對SPK1進行干涉，SPK1干涉后，SPK1、Mcl-1蛋白表達明顯受到抑制，Ad-H1一SPK1+阿霉素組細胞生存率低于對照Ad-H1+阿霉素組，48小時為對照組的71.2％，72小時為對照組的61.3％：用流式細胞儀檢測

8、Du145細胞的凋亡，Ad-H1-SPK1+喜樹堿組的平均細胞凋亡率58.3％，高于對照組Ad-H1+喜樹堿組29.1％，經(jīng)統(tǒng)計學處理，差異有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論：我們的研究結(jié)果表明，SPK信號通路可以調(diào)節(jié)非激素依賴性前列腺癌細胞Du145的凋亡，靶向SPK1的RNA干擾可以抑制Du145細胞的SPK1以及重要抗凋亡蛋白Mcl-1的表達，增加阿霉素對Du145細胞增殖的抑制，增加喜樹堿誘導的Du145細胞的凋亡。SPK