沉默DNA甲基轉(zhuǎn)移酶上調(diào)NDRG1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：
　　通過(guò)沉默 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶上調(diào) NDRG1基因，探討其對(duì)前列腺癌 DU145細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1.收集天津市泌尿外科研究所保存的12例行根治性前列腺切除術(shù)患者的前列腺癌組織及12例行根治性膀胱切除術(shù)或經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)患者的良性前列腺增生組織標(biāo)本，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及RT-qPCR方法檢測(cè)組織中DNMT1、DNMT3b及NDRG1的表達(dá)情況，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.體

2、外培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞系 DU145、PC-3及人正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1，通過(guò)RT-qPCR、Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞系中DNMT1、DNMT3b及NDRG1的表達(dá)情況，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3．參照相關(guān)資料設(shè)計(jì)DNMT1-siRNA、DNMT3b-siRNA及其陰性對(duì)照序列（ negative control， NC），分別轉(zhuǎn)染 DNMT1-siRNA、DNMT3b-siRNA、DNMT1-siRNA+

3、DNMT3b-siRNA至DU145細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（NC control）及空白對(duì)照（Control）。通過(guò)RT-qPCR、Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中DNMT1、DNMT3b和NDRG1基因表達(dá)改變。通過(guò)CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。篩選出NDRG1表達(dá)提升及細(xì)胞生物學(xué)行為改變最顯著組DU

4、145細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　4.參照相關(guān)資料設(shè)計(jì)NDRG1-siRNA及其陰性對(duì)照序列，將NDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染至上述NDRG1表達(dá)提升最顯著組的DU145細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照及空白對(duì)照。通過(guò)RT-qPCR、Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中NDRG1基因表達(dá)改變，并進(jìn)行細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡情況、細(xì)胞遷移及侵襲能力檢測(cè)，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化及RT-qPCR結(jié)果顯示，D

5、NMT1、DNMT3b在前列腺癌組織中的表達(dá)高于前列腺增生組織（P<0.05），NDRG1在前列腺增生組織中的表達(dá)高于前列腺癌組織（P<0.05）。
　　2.通過(guò)RT-qPCR及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DNMT1、DNMT3b在DU145、PC-3細(xì)胞系中的表達(dá)高于RWPE-1細(xì)胞系（P<0.05），且DNMT1、DNMT3b在DU145細(xì)胞系中的表達(dá)高于PC-3細(xì)胞系（P<0.05）；NDRG1在RWPE-1細(xì)胞系中的

6、表達(dá)高于DU145、PC-3細(xì)胞系（P<0.05）。
　　3.將DU145細(xì)胞分為5組進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，通過(guò)RT-qPCR、Western blot、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DNMT1-siRNA、DNMT3b-siRNA可顯著抑制DNMT1、DNMT3b的mRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05），顯著提升NDRG1的mRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05），顯著

7、抑制細(xì)胞增殖（P<0.05），促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P<0.05），減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。其中DNMT1-siRNA組效果最顯著，共轉(zhuǎn)染未見(jiàn)顯著協(xié)同效應(yīng)（P>0.05）。
　　4.轉(zhuǎn)染DNMT1-siRNA至DU145細(xì)胞24h后，將這些細(xì)胞分為3組再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)RT-qPCR、Western blot、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，

8、 NDRG1-siRNA可顯著抑制NDRG1的mRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05），顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（ P<0.05），減少細(xì)胞凋亡（ P<0.05），增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.DNMT1、DNMT3b在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，在正常前列腺細(xì)胞中低表達(dá)；NDRG1在前列腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，在正常前列腺細(xì)胞中高表達(dá)。
　　2.NDRG1在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用，可以抑制前列腺癌細(xì)