比格犬子宮與卵巢ERα、ERβ的表達及ERβ新剪接異構(gòu)體的研究.pdf

1、比格犬因其性情溫順,體格適中,遺傳背景清晰,均質(zhì)性好,在醫(yī)藥、公共衛(wèi)生、生命科學和軍事醫(yī)學研究領(lǐng)域,發(fā)揮著重要的作用。但目前,我國比格犬種群內(nèi)的不發(fā)情或發(fā)情不孕、休情期延長、停發(fā)情、窩產(chǎn)仔數(shù)少等情況比較常見,嚴重制約著比格犬的生產(chǎn)效率,因此,針對比格犬生殖調(diào)控機理的研究具有重要的理論與實際意義。本研究對不同發(fā)情階段比格犬卵巢與子宮內(nèi)雌激素受體ERα、ERβ蛋白的表達規(guī)律進行了研究,并對犬ERα、ERβ及可能存在的ERβ剪接異構(gòu)體進行基因

2、擴增,構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒,并瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞,對其活性進行初步研究。突出的結(jié)果是首次發(fā)現(xiàn)了比格犬ERβ的四個剪接異構(gòu)體,為深入進行比格犬ERα、ERβ及其剪接異構(gòu)體在生殖調(diào)控中的作用機制研究奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)將實驗研究報告如下。
　　1.間情期與發(fā)情期比格犬血清性激素檢測及卵巢與子宮正常組織形態(tài)的比較
　　應(yīng)用病理切片技術(shù)對間情期及發(fā)情期比格犬卵巢及子宮的正常組織形態(tài)進行比較,并對兩個發(fā)情階段比格犬血清性激素:E2、PRG

3、E、FSH和LH水平進行測定,分析其性激素變化特點和卵巢、子宮在不同階段的組織形態(tài)學特征。
　　性激素檢測結(jié)果表明:在發(fā)情期比格犬出現(xiàn)了很明顯的E2峰值,而在間情期及發(fā)情后期雌激素均維持在極低的水平。而PRGE在間情期未能檢測到,在發(fā)情期及發(fā)情后期均能檢出,并且在發(fā)情后期表達水平明顯升高。
　　組織形態(tài)學比較結(jié)果表明:間情期犬子宮及其內(nèi)膜較薄,間質(zhì)纖維增生,黃體中以初級卵泡為主,可見1-2個次級卵泡,未見成熟卵泡,卵泡和黃體

4、細胞間纖維較多、血管少。發(fā)情期犬子宮及其內(nèi)膜增厚,內(nèi)膜腺體腔較大,部分腺體呈分枝狀彎曲,腺上皮腫大,胞漿淡染,少數(shù)可見核下空泡。卵巢中卵泡數(shù)量較多,有初級、次級和1-2個成熟卵泡。黃體細胞數(shù)量多,排列規(guī)則,境界清楚,間質(zhì)纖維比較疏松,血管多,未見空泡變性。
　　2.間情期與發(fā)情期比格犬卵巢與子宮內(nèi)ERα、ERβ的定位與定量研究
　　運用免疫組織化學和圖像灰度分析法對間情期與發(fā)情期比格犬卵巢及子宮內(nèi)ERα、ERβ蛋白的表達進行

5、組織定位和半定量分析,結(jié)果如下:
　　(1)比格犬ERα、ERβ的免疫組織化學定位
　　ERα主要表達于卵泡顆粒細胞、卵巢間質(zhì)腺腺上皮細胞胞核內(nèi),胞質(zhì)內(nèi)有微弱表達,卵母細胞胞核及卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達,在卵泡膜內(nèi)膜的間質(zhì)細胞及小動脈血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞、小靜脈內(nèi)皮細胞的胞核內(nèi)也有少量表達。在膜黃體細胞的胞核,顆粒黃體細胞的胞核與胞質(zhì)內(nèi)均有表達。
　　ERβ主要表達于卵泡顆粒細胞,卵巢間質(zhì)腺的腺上皮細胞及顆粒黃體細胞

6、的核膜及胞質(zhì)內(nèi),少量表達于卵巢間質(zhì)動脈血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞、靜脈內(nèi)皮細胞的核膜及胞質(zhì)內(nèi)。
　　ERα主要表達于子宮內(nèi)膜腺體細胞胞核內(nèi),而ERβ主要表達于子宮內(nèi)膜腺體細胞核膜及胞質(zhì),在血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達。
　　BCIP/NBT與AEC雙染可見ERα、ERβ在子宮內(nèi)可表達于同一個內(nèi)膜腺體細胞,但其定位部位不同:ERα主要在核內(nèi),而ERβ主要在核膜及胞質(zhì)內(nèi)。
　　(2)ERα、ERβ半定量分析結(jié)果

7、r>　　間情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)各組成成份ERα蛋白的表達特點:間情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)腺體、卵泡及周圍基質(zhì)、黃體各組份ERα表達的變化以腺體(0.03297±0.004075 vs 0.06647±0.008961,P<0.01)和黃體(0.01286±0.003219 vs 0.06241±0.007671,P<0.01)為顯著,在發(fā)情期的表達水平均較間情期顯著增加。表明ERα蛋白主要表達于發(fā)情期卵巢腺體及黃體內(nèi)。
　　間

8、情期與發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)各組成成份ERβ蛋白的表達特點:由間情期發(fā)展至發(fā)情期,比格犬卵巢生長卵泡、初級卵泡、黃體、間質(zhì)血管各組份中,生長卵泡ERβ表達水平顯著增加(0.04471±0.004291 vs 0.1300±0.03970,P<0.01),黃體內(nèi)ERβ表達水平顯著下降(0.1515±0.02711 vs 0.1008±0.02247,P<0.01),但黃體內(nèi)ERβ的起始表達水平很高,與初級卵泡及間質(zhì)血管中的表達水平(0.018

9、79±0.001484)比較仍保持在較高的水平。初級卵泡及卵巢間質(zhì)血管中ERβ保持在相對較低的水平。表明在卵巢內(nèi)ERβ蛋白主要表達于生長卵泡及黃體內(nèi)。
　　間情期與發(fā)情期比格犬ERα、ERβ蛋白在卵巢內(nèi)的表達特點:在間情期及發(fā)情期比格犬卵巢內(nèi)ERβ的表達水平顯著高于ERα(間情期:0.08646±0.008002 vs 0.02398±0.001911,P<0.01;發(fā)情期:0.09007±0.007534 vs 0.04691±

10、0.003052,P<0.01)比格犬卵巢內(nèi)ERα在由間情期發(fā)展至發(fā)情期時表達水平顯著增加(0.02398±0.001911 vs 0.04691±0.003052,P<0.01),而ERβ在兩個生理階段基本保持不變(0.08646±0.008002 vs 0.09007±0.007534,P>0.05),但與ERα比較,維持在較高的表達水平。說明在間情期與發(fā)情期卵巢內(nèi)均以ERβ的表達占主導地位。
　　間情期與發(fā)情期比格犬ERα、

11、ERβ蛋白在子宮內(nèi)的表達特點:在比格犬子宮內(nèi),在間情期,ERα、ERβ都有表達,但都維持在相對較低的水平,并且兩者的表達水平無顯著差異(0.02855±0.008855 vs 0.02908±0.003865,P>0.05),而發(fā)展至發(fā)情期時,ERα的表達水平顯著增加(0.02855±0.008855 vs 0.04896±0.006833,P<0.01),ERβ仍維持在相對較低的水平(0.02170±0.003959)。由此得出結(jié)論在

12、發(fā)情期比格犬子宮內(nèi),ERα為優(yōu)勢表達的雌激素受體亞型。
　　3.ERα、ERβ及ERβ新剪接異構(gòu)體的擴增與鑒定
　　應(yīng)用RT-PCR擴增了ERα和ERβ的全長編碼序列:ERα1791和ERβ1593,并首次篩選出了ERβ的四個選擇性剪接異構(gòu)體:第4外顯子完整缺失的一個;第7外顯子完整缺失的一個;部分第4和部分第5外顯子組合缺失的兩個。應(yīng)用5`3`RACE對第4外顯子完整缺失的ERβ1293及第7外顯子完整缺失的ERβ1257

13、兩個剪接異構(gòu)體擴增出其全長編碼序列。ERα1791分子量為66kD,ERβ1593分子量為59kD;ERβ1293缺失300bp,編碼430aa,分子量為48kD;ERβ1257缺失181bp,編碼418aa,分子量為47kD,堿基的缺失造成了讀碼移位,使翻譯提前終止,在其終止密碼子前插入10個非編碼ERβ氨基酸殘基。訖今,我們尚未查到關(guān)于比格犬ERβ的剪接異構(gòu)體的研究報道。本實驗首次發(fā)現(xiàn)比格犬ERβ的四個剪接異構(gòu)體,擴增出其中兩個的全

14、長編碼序列,并且證明其在瞬時轉(zhuǎn)染的293T細胞中能夠翻譯成蛋白質(zhì)。
　　4.ERα、ERβ及ERβ剪接異構(gòu)體真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建及活性的初步研究
　　構(gòu)建了pEGFP-n1-ERα1788,pEGFP-n1-ERβ1590,pEGFP-n1-ERβ1290,pEGFP-n1-ERβ1254真核表達重組質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞,提取細胞總蛋白,經(jīng)WB驗證ERα1788、ERβ1590、ERβ1290、ERβ1254在體外均