三種蝦蟹Cyclin B的定位和分子克隆.pdf

1、生物的生長(zhǎng)發(fā)育需要對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行精確協(xié)調(diào)的時(shí)空調(diào)控，而細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)是細(xì)胞周期的推動(dòng)力。細(xì)胞周期蛋白有多種，Cyclin B為其中一種，與催化亞基cdc2組成全酶復(fù)合物，即成熟促進(jìn)因子(MPF)，參與細(xì)胞分裂的多個(gè)事件的發(fā)生和進(jìn)行。本文采用免疫組化方法和分子生物學(xué)技術(shù)，在擬穴青蟹的精巢中定位了Cyclin B蛋白，克隆了長(zhǎng)毛明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦卵巢Cyclin B基因，從而為甲殼類生殖調(diào)控機(jī)制的研究及水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展提供基礎(chǔ)資

2、料。主要結(jié)果如下： 1.擬穴青蟹精巢Cyclin B蛋白的免疫組化定位。 運(yùn)用組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法，確定了所選擬穴青蟹精巢的成熟程度，然后對(duì)擬穴青蟹精巢中的Cyclin B蛋白進(jìn)行定位。在所選擬穴青蟹的精巢組織中，Cyclin B蛋白主要分布在精母細(xì)胞期，直至精子細(xì)胞仍然存在。Cyclin B蛋白在精母細(xì)胞中大量表達(dá)，在精子細(xì)胞少量，出現(xiàn)陽(yáng)性的精母細(xì)胞的染色質(zhì)有的濃縮成團(tuán)，反之則成染色質(zhì)絲，其中濃縮成團(tuán)的精母細(xì)胞的

3、陽(yáng)性結(jié)果更為明顯。上述結(jié)果表明：在擬穴青蟹精子發(fā)生過(guò)程中，Cyclin B表達(dá)和蛋白定位具有發(fā)育階段依賴性的特征。陰性對(duì)照組未出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)。 2.長(zhǎng)毛明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦Cyclin B基因的克隆和分析。 運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，分別研究長(zhǎng)毛明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦卵巢Cyclin B基因，結(jié)果如下： ①分別克隆長(zhǎng)毛明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦卵巢Cyclin B基因 在NCBI上查找已報(bào)道的Cyclin B基因序列，通過(guò)對(duì)已

4、知物種的CyclinB序列比對(duì)，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti，GeneBank登錄號(hào)：XM_001660578)、麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis，GeneBank登錄號(hào)：XM_001605776)、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus，GeneBank登錄號(hào)：AY769095)、水蚤(Daphniapulex，Joint Genome Institute，JGI)，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物

5、BFP和BRP，擴(kuò)增出了長(zhǎng)毛明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦Cyclin B基因的片段。根據(jù)己得到序列片段設(shè)計(jì)引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增和基因克隆等分子生物學(xué)技術(shù)，分別克隆出長(zhǎng)毛明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦Cyclin B基因的全長(zhǎng)cDNA序列，推導(dǎo)出其氨基酸序列，并提交給GeneBank。 長(zhǎng)毛明對(duì)蝦Cyclin B基因序列全長(zhǎng)為1927bp，含有一個(gè)完整的開放閱讀框，長(zhǎng)1428bp，編碼的成熟肽有475個(gè)氨基酸組成，分子量的理論值為54763.

6、7Da，等電點(diǎn)為6.19，推測(cè)該成熟肽有6個(gè)可能的氨基酸磷酸化位點(diǎn)，不具信號(hào)肽。分析該蛋白可能定位于細(xì)胞核內(nèi)。 凡納濱對(duì)蝦Cyclin B基因序列全長(zhǎng)為2326bp，含有一個(gè)完整的開放閱讀框，長(zhǎng)1803bp，編碼的成熟肽有600個(gè)氨基酸組成，分子量的理論值為69688.0Da，等電點(diǎn)為6.32，推測(cè)該成熟肽有9個(gè)可能的氨基酸磷酸化位點(diǎn)，不具信號(hào)肽。分析該蛋白可能定位于細(xì)胞核內(nèi)。 ②長(zhǎng)毛明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦Cyclin B基

7、因同源性分析。 推測(cè)長(zhǎng)毛明對(duì)蝦演繹的Cyclin B蛋白有兩個(gè)拷貝的氨基酸保守區(qū)，分別位于248—333和341—427位氨基酸之間，屬于細(xì)胞周期蛋白超家族(Cyclin Super—family)，是細(xì)胞周期蛋白盒(Cyclin box)的折疊區(qū)域。每個(gè)拷貝里面都有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)包括9個(gè)氨基酸位點(diǎn)，第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)包括6個(gè)氨基酸位點(diǎn)，為與CDK、DNA結(jié)合提供識(shí)別位點(diǎn)和折疊區(qū)域，在細(xì)胞周期和翻譯過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。長(zhǎng)

8、毛明對(duì)蝦的Cyclin B基因與日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)的同源性高達(dá)93％，而與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、帽貝(Patellavulgata)、斑紋蚌(Dreissena polymorpha)、大西洋浪蛤(Spisula solidissima)、水螅(Hydra viridis)分別有71％、61％、60％、59％、57％的同源性。 推測(cè)凡納濱對(duì)蝦演繹的Cyclin

9、B蛋白有一個(gè)拷貝的氨基酸保守區(qū)，該氨基酸保守區(qū)位于367—458位的氨基酸，屬于細(xì)胞周期蛋白超家族，氨基酸保守區(qū)里包含兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)包括2個(gè)氨基酸位點(diǎn)，第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)包括5個(gè)氨基酸位點(diǎn)，為與CDK、DNA結(jié)合提供識(shí)別位點(diǎn)和折疊區(qū)域，在細(xì)胞周期和翻譯過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。凡納濱對(duì)蝦的Cyclin B基因與其它特種的Cyclin B具有不同序列一致性。與日本囊對(duì)蝦的同源性達(dá)91％，而與中華絨螯蟹、帽貝、斑紋蚌、大西洋浪蛤、水螅、綠