TAK1在卵巢惡性上皮腫瘤中的表達及其對紫杉醇在SKOV3和OVCAR3細胞中的化療增敏研究.pdf

1、卵巢上皮性惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，位于婦科惡性腫瘤的第三位，全球每年新診斷病例約24萬人，死亡病例約15萬人。雖然近年來由于TC（紫杉醇、卡鉑）、TP（紫杉醇、順鉑）、D C（多西他賽、卡鉑）等有效化療方案的應用，使得卵巢癌的治療效果有了明顯提高，但是其5年生存率也僅僅在25%-30%之間?，F在對于復發(fā)性卵巢癌缺乏有效的治療手段，因此目前對于卵巢上皮性癌的治療效果一直未能與卵巢惡性生殖

2、細胞腫瘤那樣出現質的飛躍，導致卵巢惡性腫瘤致死率居婦科惡性腫瘤的首位。卵巢癌的高死亡率主要是歸功于腫瘤細胞出現對細胞毒類的化療藥物抵抗和一些細胞克隆發(fā)展成復發(fā)腫瘤，因此對化療藥物耐藥是卵巢癌治療過程中常見并且是富有挑戰(zhàn)性的問題。
　　轉化生長因子β激活激酶1（TAK1或稱MAP3K7）是細胞內的分子中心，于1995年經對cDNA文庫篩選和蛋白碎片互補分析時在轉化生長因子β通路中被發(fā)現，它調控著NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶MAPK

3、信號通路，在細胞生存，免疫應答，新陳代謝和致癌中起到關鍵作用，其主要通過TAK1-NF-κB途徑抑制凋亡蛋白酶的激活從而阻止了凋亡細胞的死亡導致細胞發(fā)生無限增殖，引起腫瘤的發(fā)生。最近的研究表明TAK1在多種惡性腫瘤中異常表達。由此可見TAK1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用。然而關于TAK1在卵巢癌中的表達情況以及TAK1在卵巢癌中的發(fā)生、發(fā)展中作用特別是對于耐受紫杉醇的卵巢癌中的作用，國內外相關的報道較少。
　　基于此種情況

4、，本研究的目的是對TAK1在卵巢癌組織和接受紫杉醇治療復發(fā)卵巢癌組織中的表達情況進行檢測，并通過RNAi技術和TAK1的特異抑制劑5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3和OVCAR3細胞系中的TAK1的表達，建立耐受醇的SKOV3PR細胞系，觀察TAK1的表達情況及其對細胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響；建立雌性裸鼠的移植瘤模型，觀察抑制了TAK1后移植瘤對紫杉醇治療的反應，探討TAK1在卵巢癌中的預后價值及TAK1在卵巢癌發(fā)生

5、發(fā)展過程中的作用，試圖建立抑制TAK1在紫杉醇治療卵巢癌中的潛在的抗腫瘤潛能，并期待這些實驗室數據能夠改變卵巢癌患者的臨床治療效果。
　　第一部分：TAK1蛋白在卵巢組織及卵巢癌細胞中的差異表達及其臨床意義
　　目的:觀察TAK1在卵巢癌組織及其復發(fā)組織中的表達情況，探討TAK1的表達與卵巢癌的臨床病理參數及預后之間的關系，同時觀察TAK1在SKOV3細胞和耐受紫杉醇的SKOV3PR細胞之間的表達特征。
　　方法：采用

6、western-blotting方法檢測卵巢癌細胞系SKOV3及耐受紫杉醇的SKOV3PR細胞系中的TAK1及p-TAK1蛋白的表達及Q-PCR檢測兩種細胞中TAK1mRNA的表達情況，采用免疫組織化學半定量法檢測了原發(fā)卵巢癌組織和復發(fā)卵巢癌組織中的TAK1及p-TAK1的表達情況并隨訪患者的生存情況。
　　結果：免疫組化結果分析顯示在復發(fā)組織中，TAK1的表達水平要高于原發(fā)組織（p=0.0076），與之相應的，p-TAK1的活性

7、在復發(fā)組織中的活性要高于原發(fā)腫瘤組織(p=0.021)；TAK1的表達與患者FIGO分期、p53蛋白表達及有無淋巴結轉移無明顯相關性，但是生存分析曲線顯示高表達的TAK1與較差的整體生存期（OS）顯著相關（p=0.031）；TAK1mRNA在SKOVPR細胞中的表達要顯著高于SKOV3細胞（P=0.014）；western blot結果顯示 TAK1及p-TAK1蛋白在SKOV3的表達要顯著低于SKOV3PR細胞系中的表達(p=0.00

8、8與0.009)。
　　結論：TAK1參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，對紫杉醇產生耐受的卵巢癌細胞表現出TAK1及p-TAK1的過表達，TAK1可能是卵巢癌的不良預后分子標記物。
　　第二部分：抑制TAK1的表達對卵巢癌SKOV3及OVCAR3及耐紫杉醇的SKOV3PR細胞的生物學行為的影響
　　目的：通過siRNA和5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3細胞SKOV3PR細胞和OVCAR3細胞中的TAK1的表

9、達，分析沉默了TAK1的表達對不同卵巢癌細胞的增殖、凋亡及侵襲能力的影響，觀察TAK1沉默后紫杉醇對不同卵巢癌細胞的細胞毒作用。
　　方法：使用兩個獨立的TAK1靶向siRNAs(signalSilence○R siRNAⅠ＃6317和Ⅱ#6318)轉染SKOV3和OVCAR3細胞，同時設立陰性對照組siRNAs(signalSilence○R control siRNA#6201),western blotting方法檢測不同卵

10、巢癌細胞中TAK1、p-TAK1蛋白的表達。使用CCK-8實驗、Annexin V-FITC/PI雙標記試驗和流水細胞實驗分析轉染抑制TAK1后的腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性變化及經過紫杉醇處理和5Z-7-oxozeaenol處理后的增殖、凋亡以及侵襲能力的變化。
　　結果：沉默TAK1能夠顯著提高紫杉醇在SKOV3和OVCAR3細胞中的敏感性，5Z-7-oxozeaenol對于抑制TAK1的磷酸化抑制呈劑量依賴，5Z-7-oxoze

11、aenol增加紫杉醇的細胞毒性的能力隨著其濃度的增加而顯著增加，在SKOV3細胞系中如無5Z-7-oxozeaenol處理，紫杉醇的IC50為2.5而在SKOV3PR中，如無5Z-7-oxozeaenol處理，則其IC50值為236。PI染色的SKOV3細胞使用流式細胞分析發(fā)現紫杉醇能夠增加G2/M期細胞比例，而SKVO3RP細胞對此并無此種反應，而同時給予5Z-7-oxozeaenol處理后，此種現象會再現。凋亡檢測發(fā)現紫杉醇組引起的

12、凋亡與對照組相比較細胞凋亡明顯上升（p=0.02）而紫杉醇+TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol組和對照組、5Z-7-oxozeaenol組及單獨使用紫杉醇組相比較差異有顯著意義（p=0.001）。
　　結論：沉默TAK1的表達能夠增強紫杉醇對卵巢癌細胞的細胞毒作用，5Z-7-oxozeaenol提高紫杉醇的細胞毒作用呈劑量依賴性，耐受紫杉醇的卵巢細胞對于聯(lián)合使用了TAK1抑制5Z-7-oxozeaenol和紫杉醇更為敏感

13、；聯(lián)合使用紫杉醇和TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol能夠誘導G2/M捕獲并能促進細胞凋亡。
　　第三部分：聯(lián)合使用TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol和紫杉醇對無胸腺小鼠種植瘤生長的影響
　　目的：通過TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol聯(lián)合紫杉醇處置卵巢移植瘤動物模型，觀察其對裸鼠卵巢癌移植瘤生長及裸鼠成長的影響并評估其安全性。
　　方法：60只無胸腺雌性小鼠隨機分成4組（對照組、紫杉醇組、

14、5z-7-oxozeaenol組、紫杉醇聯(lián)合5z-7-oxozeaenol組），每組15只，給予皮下注射SKOV3細胞5*106個細胞/每注射；建立卵巢癌移植瘤動物模型，待到皮下腫瘤可觸及時給予紫杉醇8mg/kg和5z-7-oxozeaenol6.5mg/kg處理四周期后，處死小鼠前2小時給予腹膜腔內注射BrdU150mg/kg，記錄小鼠體重變化，稱量小鼠脾臟重量及切除的腫瘤重量，腫瘤細胞懸浮呈單細胞由流式細胞儀記錄腫瘤細胞總數和陽性染

15、色腫瘤細胞數，檢測腫瘤細胞增殖。
　　結果：紫杉醇聯(lián)合5z-7-oxozeaenol處理組的移植瘤質量要顯著低于其他三組(p<0.01)，BrdU檢測腫瘤細胞百分比顯著降低（p<0.01）；5z-7-oxozeaenol處理的小鼠顯示了更低的p-TAK1/TAK1比例（p<0.01）；各組之間的小鼠體重及脾臟重量無顯著差異。
　　結論：紫杉醇聯(lián)合TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol能夠有效的抑制卵巢癌移植瘤的生長，并