黃酮類化合物對(duì)乏氧卵巢癌SKOV3細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響及其放射增敏作用研究.pdf

1、卵巢癌是困擾女性生殖系統(tǒng)的三大惡性實(shí)體瘤之一，其死亡率居于婦科腫瘤首位，成為女性生命健康的嚴(yán)重威脅。放療是卵巢癌除手術(shù)和化療之外的第三大治療手段，常常作為術(shù)后輔助或姑息性療法，但因不同組織來(lái)源的卵巢癌細(xì)胞對(duì)射線的敏感性有所不同，加之腫瘤細(xì)胞中乏氧細(xì)胞的存在，導(dǎo)致療效仍然有限。腫瘤在快速生長(zhǎng)過(guò)程中由于氧彌散障礙、血流不暢等原因?qū)е录?xì)胞出現(xiàn)不同程度的乏氧情況。乏氧細(xì)胞對(duì)射線有抵抗性，嚴(yán)重影響放療質(zhì)量，且與腫瘤不良預(yù)后高度相關(guān)。因此，如何提高

2、乏氧腫瘤細(xì)胞的放射敏感性成為腫瘤放射治療學(xué)長(zhǎng)期以來(lái)的熱點(diǎn)課題。
　　HIF-1是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)缺氧應(yīng)答因子，與腫瘤的放射敏感性密切相關(guān)。細(xì)胞受到輻照后HIF-1α調(diào)控的100余種基因被激活，這些基因涉及能量代謝、血管生成及細(xì)胞增殖、代謝、運(yùn)動(dòng)、自噬、凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)，使腫瘤細(xì)胞快速適應(yīng)缺氧微環(huán)境，提高對(duì)射線的抵抗性。因此通過(guò)干預(yù)HIF-1α的活性可改善乏氧細(xì)胞的敏感性。
　　本研究在模擬乏氧條件下培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞

3、，以乏氧SKOV3細(xì)胞為研究對(duì)象，研究染料木黃酮、白楊素、槲皮素、燈盞花素四種黃酮類化合物對(duì)乏氧SKOV3細(xì)胞的放射增敏作用，并以已上市的天然乏氧細(xì)胞增敏劑馬藺子素為陽(yáng)性對(duì)照，選擇一種放射增敏作用最強(qiáng)的藥物，探討黃酮類化合物對(duì)HIF-1α的影響及放射增敏機(jī)制。通過(guò)這些研究為尋找乏氧腫瘤細(xì)胞放射增敏劑及腫瘤放射治療提供新的思路和方法。具體內(nèi)容如下:
　?。ㄒ唬┓ρ趼殉舶㏒KOV3細(xì)胞模型的建立及檢驗(yàn)
　　本實(shí)驗(yàn)用厭氧產(chǎn)氣袋法建

4、立了乏氧卵巢癌SKOV3細(xì)胞模型，并用克隆形成法、MTT法、乏氧標(biāo)志物法等三種方法檢驗(yàn)了該模型的可行性。結(jié)果表明三種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但都可不同程度地證明本實(shí)驗(yàn)中乏氧模型的成功建立，所得結(jié)果一致。
　　（二）黃酮類化合物對(duì)常氧及乏氧SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)染料木黃酮、白楊素、槲皮素、燈盞花素以及陽(yáng)性對(duì)照藥馬藺子素對(duì)常氧及乏氧SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并篩選出無(wú)毒濃度范圍。結(jié)果表明，一定濃度范

5、圍的染料木黃酮、白楊素、槲皮素、燈盞花素、馬藺子素在常氧及乏氧條件下均對(duì)SKOV3細(xì)胞存活率產(chǎn)生抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05)，常氧條件下作用72h的IC50分別為47.45μg/ml,29.15μg/ml,75.98μg/ml,148.78μg/ml,38.77μg/ml,乏氧條件下作用72h的IC50分別為45.70μg/ml，24.72μg/ml，75.68μg/ml，151.46μg/ml,33.26μg/ml。

6、r>　　（三）黃酮類化合物對(duì)常氧及乏氧SKOV3細(xì)胞的放射增敏作用
　　選擇無(wú)毒濃度范圍內(nèi)高、中、低濃度的黃酮類化合物，采用MTT法檢測(cè)黃酮類化合物對(duì)常氧及乏氧SKOV3細(xì)胞放射敏感性的影響。結(jié)果表明，根據(jù)放射增敏比(SER)，四種黃酮類化合物及陽(yáng)性對(duì)照藥馬藺子素的放射增敏作用由強(qiáng)到弱依次為馬藺子素＞染料木黃酮＞白楊素＞槲皮素＞燈盞花素，其中燈盞花素基本無(wú)放射增敏作用。故選擇SER最接近于馬藺子素的染料木黃酮進(jìn)行放射增敏的機(jī)制研究

7、。
　　（四）黃酮類化合物對(duì)乏氧SKOV3細(xì)胞HIF-1α表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路的影響
　　SKOV3細(xì)胞經(jīng)過(guò)乏氧處理后，用9μg/ml染料木黃酮作用24h，接受6Gy射線照射，采用免疫熒光法和Western blot檢測(cè)染料木黃酮對(duì)乏氧SKOV3細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路的影響。Western blot結(jié)果顯示乏氧可明顯升高SKOV3細(xì)胞內(nèi)HIF-1蛋白的水平，染料木黃酮?jiǎng)t可抑制乏氧SKOV3細(xì)胞內(nèi)HIF-1的表達(dá)

8、，與射線聯(lián)用可進(jìn)一步降低HIF-1的水平，說(shuō)明染料木黃酮的放射增敏作用可能與此相關(guān)。該抑制作用可能是通過(guò)抑制HIF-1上游的Ras/Raf/MEK-1/ERK1-2信號(hào)通路和/或上調(diào)介導(dǎo)其進(jìn)入降解途徑的p53蛋白的水平而實(shí)現(xiàn)，對(duì)上游的另一條信號(hào)通路—PI3K/Akt/mTOR通路則影響甚微。
　?。ㄎ澹S酮類化合物對(duì)乏氧SKOV3細(xì)胞放射增敏機(jī)制的研究
　　SKOV3細(xì)胞經(jīng)過(guò)乏氧處理后，用3μg/ml、9μg/ml染料木黃酮

9、作用24h，接受X射線照射，用Hoechst33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡并以熒光顯微鏡觀察，PI單染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，用免疫熒光法和Westernblot檢測(cè)γ-H2AX蛋白表達(dá)來(lái)觀察DSB情況。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮單獨(dú)使用或與射線聯(lián)用均可提高乏氧SKOV3細(xì)胞的凋亡率，且呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05);對(duì)γ-H2AX蛋白進(jìn)行免疫熒光染色和Western blot實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)染料木黃酮可增加DNA雙鏈斷裂，抑制