黃酮類化合物

1、,第五章黃酮類化合物,黃酮類化合物廣泛存在于自然界，多具有顏色，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷，一部分以游離形式存在。,分布概況存在科屬：存在于雙、單子葉植物、裸子、蕨類植物、 低等植物常見中藥：槐米

2、、黃芩、葛根、銀杏、桑葉等存在部位與形式： 花、果、葉 ----以苷為主要存在形式 木部---多為游離狀態(tài) 皮、根、莖部位--- 兩種存在形式,一、基本結(jié)構(gòu) 以前，黃酮類化合物主要是指基本母核2-苯基色原酮類化合物，現(xiàn)在則是泛指兩個(gè)苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。,第一節(jié) 結(jié)構(gòu)類

3、型,,黃酮的基本骨架是由三個(gè)丙二酰輔酶A和一個(gè)桂皮酰輔酶A生物合成而產(chǎn)生的。A環(huán)來自于三個(gè)丙二酰輔酶A，而B環(huán)則來自于桂皮酰輔酶A。,A,C,B,二、分類根據(jù)中間三碳鏈的氧化程度、是否成環(huán)、3-位是否有羥基、B環(huán)的連接位置等特點(diǎn)進(jìn)行分類：,（一）黃酮類和黃酮醇類,（二）二氫黃酮類和二氫黃酮醇類,（三）異黃酮類和二氫異黃酮類,（四）查耳酮類和二氫查耳酮類,（五）橙酮類,（六）雙黃酮類,（七）其他黃酮類,,,,,,,,,黃酮（醇）類 基本

4、結(jié)構(gòu),,,,黃酮類成分,,,木犀草素,黃芩苷,槲皮素 R= H蘆 丁 R= 蕓香糖,,山柰酚 楊梅素,基本結(jié)構(gòu),,,,新橙皮苷,,橙皮苷,甘草素R=H甘草苷R=glu,水飛薊素,黃柏素--7--O-葡萄糖苷,,異黃酮類基本結(jié)構(gòu),,二氫異黃酮,R1=R2=R3=H 大豆素R1=R3=H R2=glc

5、 大豆苷R2=R3=H R1=glc 葛根素,,魚藤酮,,查耳酮類基本結(jié)構(gòu),查耳酮,紅花苷,補(bǔ)骨脂乙素,,二氫查耳酮,橙酮類基本結(jié)構(gòu),,雙黃酮類基本結(jié)構(gòu),,,柏黃酮,扁柏黃酮,其他黃酮類：,1、花色素類,2、黃烷醇類,3、雙苯吡酮類,,,,,花色素基本結(jié)構(gòu)：,花色素,,黃烷醇類成分,,無色矢車菊素 R1=OH R2=H無色飛燕草素 R1= R2= OH,黃烷-3-醇類,黃烷-3，4-二醇類,雙苯吡酮類基本結(jié)構(gòu)：,,,天

6、然黃酮苷類化合物，由于糖的種類、數(shù)量、連接位置及聯(lián)接方式不同，組成各種各樣的黃酮苷類：單糖類：D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-葡萄糖醛酸等。雙糖類：槐糖（glc ?1→2 glc）、龍膽二糖(glc ?1→6 glc)、蕓香糖(rh ?1→6 glc)、新橙皮糖（rh ?1→2 glc）、刺槐二糖（rh ?1→6 gal）等。,,叁糖類：龍膽三糖(glc ?1→6 glc ?1→2 fru)、

7、槐三糖(glc ?1→2 glc ?1→2 glc)等。酰化糖類：2-2酰葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖(caffeoylglucose)等。 黃酮苷中糖的聯(lián)接位置與苷元的結(jié)構(gòu)類型有關(guān)。如黃酮醇類常形成3-， 7-， 3’-， 4‘-單糖苷，或3，7-， 3，4’-及7，4’-雙糖鏈苷等。,,1、性狀 黃酮類化合物多為晶狀固體，少數(shù)（如黃酮苷類）為無定形粉末。2、旋光性 苷元中，二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃烷及黃烷醇

8、具有手性碳，具旋光性，其余黃酮類無旋光性。苷類結(jié)構(gòu)中含糖的部分結(jié)構(gòu)，故均有旋光性，且多為左旋。,第二節(jié) 理化性質(zhì),3、顏色 黃酮的色原酮部分無色，在2-位上引入苯環(huán)后，即形成交叉共軛體系，使共軛鏈延長，因而呈現(xiàn)出顏色。黃酮、黃酮醇及其苷類多顯灰黃~黃色，查耳酮為黃~橙黃色，異黃酮類顯微黃色，二氫黃酮、二氫黃酮醇不顯色。,,在上述黃酮、黃酮醇分子中，尤其在7-位及4’-位引入—OH及—OCH3等供電基后，化合物的顏色加深，但在其它位

9、置引入—OH、—OCH3等供電基影響較小。 花色苷及其苷元的顏色隨pH不同而改變，一般顯紅色( pH? 7 )、紫色( pH8.5 )、藍(lán)色( pH?8.5 )等顏色。,,4、溶解度 一般來說，游離苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑及稀堿液中?；ㄉ赵ɑㄇ嗨兀╊愐噪x子形式存在，水溶度較大。黃酮類苷元分子中羥基數(shù)越多，水中的溶解度越大。 黃酮苷類，水溶性比相應(yīng)苷元大；糖鏈越長，則水溶

10、度越大，一般易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑中，但難溶或不溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑中。,,5、酸堿性,（1）酸性 多具有酚羥基，故顯酸性，酚羥基數(shù)目不同及位置不同，酸性強(qiáng)弱也不同。7，4’-OH>7-或4’-OH>一般酚OH>3、5-OH,（二）堿性,γ吡喃環(huán)上的1-氧原子，因有未共用的電子對，故表現(xiàn)微弱的堿性。可與強(qiáng)酸成不穩(wěn)定的鹽。,,6、顯色反應(yīng) 顏色反應(yīng)多與分子中的酚

11、羥及γ-吡喃酮環(huán)有關(guān)。,（一）還原試驗(yàn)1. 鹽酸-鎂粉（或鋅粉）反應(yīng) 為鑒定黃酮類化合物最常用的顏色反應(yīng)。黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物顯橙紅~紫紅色，少數(shù)顯紫~藍(lán)色。2. 四氫硼鈉（鉀）反應(yīng) NaBH4 選擇性還原二氫黃酮（醇）類化合物。與二氫黃酮類化合物產(chǎn)生紅~紫色。,(二)金屬鹽類試劑絡(luò)合反應(yīng),2、鉛鹽 常用1%醋酸鉛及堿式醋酸鉛溶液。,醋酸鉛→鄰二酚羥基或兼有締合酚羥基（ 3-OH 、4-酮基或5-O

12、H 、4-酮基） （鮮黃→橙↓)堿式醋酸鉛→鄰二酚羥基及單一酚羥基↓,可用于鑒定，也可用于提取及分離工作。,1、鋁鹽 常用試劑為1%三氯化鋁或硝酸鋁溶液。生成的絡(luò)合物有黃綠色熒光，可用于定性及定量分析。,3.鋯鹽,2%二氯氧鋯甲醇溶液 有游離的3-或5-OH時(shí)，可生成黃色的絡(luò)合物。絡(luò)合穩(wěn)定性 3-羥基、4-酮基 > 5-羥基、 4-酮基加枸櫞酸 ，5-OH黃酮褪色，3-OH黃酮仍呈鮮黃色。,5.氯化鍶（SrCl2）,

13、常用醋酸鎂鉀溶液為顯色劑，二氫黃酮(醇)類可顯天藍(lán)色熒光，黃酮(醇)及異黃酮類等則顯黃 ~橙黃~褐色。,4.鎂鹽,在氨性甲醇溶液中，可與分子中具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物生成綠色~棕色乃至黑色沉淀。,6.三氯化鐵反應(yīng),三氯化鐵水溶液或醇溶液為常用的酚類顯色劑。,（三）硼酸顯色劑,鑒別5-OH黃酮或2’-羥基查耳酮類結(jié)構(gòu)。亮黃色。,2、黃酮醇類在堿性中先呈黃色，通入空氣后變?yōu)樽厣?，?jù)此可與其它黃酮類區(qū)別。,3、黃酮有鄰二酚羥基或3，4

14、’-二羥基，易被氧化，由黃色→深紅色→綠棕色沉淀。,（四） 堿性試劑顯色反應(yīng) 酚羥基黃酮黃色加深,1、二氫黃酮類開環(huán)，轉(zhuǎn)變成查耳酮類 （橙~黃色）。,,一、提取 黃酮苷類以及極性稍大的苷元（如羥基黃酮等），一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇提取。一些多糖苷類可用沸水提取。在提取花青素類化合物時(shí)，可加入少量酸（0.1%鹽酸，應(yīng)當(dāng)慎用，避免發(fā)生水解）。 大多數(shù)黃酮苷元宜用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等中極性溶劑提取，而對多甲氧基

15、黃酮類游離苷元，甚至可用苯等低極性溶劑進(jìn)行提取。,第三節(jié) 提取與分離,,對得到的粗提物可進(jìn)行下列精制處理，常用方法有：（一）溶劑萃取法 利用黃酮類化合物與混入的雜質(zhì)極性不同，選用不同溶劑進(jìn)行地萃取可達(dá)到精制純化目的。例如植物葉子的醇浸液，可用石油醚處理，以便除去葉綠素、胡蘿卜素等脂溶性色素。而某些藥料水溶液則可加入多倍量濃醇，以沉淀除去蛋白質(zhì)、多糖類等水溶性雜質(zhì)。,,有時(shí)溶劑萃取過程也可以用逆流分配法連續(xù)進(jìn)行。常用的溶劑系統(tǒng)

16、有：水-乙酸乙酯，正丁醇-石油醚等。 溶劑萃取過程在除去雜質(zhì)的同時(shí)，往往還可以收到分離苷和苷元或極性苷元與非極性苷元的效果。,,（二）堿提取酸沉淀法 黃酮苷類雖有一定極性，可溶于水，但卻難溶于酸性水，易溶于堿性水，故可用堿性水提取，再于堿水提取液中加入酸，黃酮苷類即可沉淀析出。此法簡便易行，如蘆丁、橙皮苷、黃芩苷的提取都應(yīng)用了這個(gè)方法。,,茲以從槐米中提取蘆丁為例說明該法的操作過程。 槐米（槐樹Sop

17、hora japonica L. 花蕾）加約6倍量水，煮沸，在攪拌下緩緩加入石灰乳至pH8-9，在此pH條件下微沸20-30分鐘，趁熱抽濾，殘?jiān)显偌?倍水煎1次，趁熱抽濾。合并濾液在60-70℃下，用濃鹽酸調(diào)至pH為5，攪勻，靜置24小時(shí)，抽濾。沉淀物水洗至中性，60℃干燥得蘆丁粗品，于水中重結(jié)晶，70-80℃干燥得蘆丁純品。,,在用堿酸法進(jìn)行提取純化時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意所用堿液濃度不宜過高，以免在強(qiáng)堿性下，尤其加熱破壞黃酮母核。在加酸酸化

18、時(shí)，酸性也不宜過強(qiáng)，以免生成佯鹽，致使析出的黃酮類化合物又重新溶解，降低產(chǎn)品收率。 當(dāng)藥料中含有大量果膠、粘液等不溶性雜質(zhì)時(shí)，如花、果類藥材，宜用石灰乳或石灰水代替其它堿性水溶液進(jìn)行提取，以使上述含羥基的雜質(zhì)生成鈣鹽沉淀，不致溶出。這也有利于黃酮類化合物的純化處理。,,（三）碳粉吸附法 主要適于苷類的精制工作。通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，攪拌，靜置，直至定性檢查上清液無黃酮反應(yīng)時(shí)為止。過濾，收集吸收炭

19、末，依次用沸甲醇、沸水、7%酚/水、15%酚/醇溶液進(jìn)行洗脫，各部分洗脫液進(jìn)行定性檢查（或用PC鑒定）。,,二、分離 現(xiàn)將較常用的方法介紹如下： （一）柱層析法 分離黃酮類化合物常用的吸附劑或載體有硅膠、聚酰胺及纖維素粉等。此外，也有用氧化鋁、氧化鎂及硅藻土等。,1. 硅膠柱層析：此法應(yīng)用范圍最廣，主要適于分離異黃酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黃酮及黃酮醇類。少數(shù)情況下，在加水去活化后也可用于

20、分離極性較大的化合物，如多羥基黃酮醇及其苷類等。吸附規(guī)律：極性大吸附牢。如：A 苷元 B 單糖苷 C 二糖苷Rf :A>B>C,2. 聚酰胺柱層析：其吸附強(qiáng)度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基的數(shù)目與位置及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。 聚酰胺柱層析可用于分離各種類型的黃酮類化合物，包括苷及苷元、查耳酮與二氫黃酮等黃酮類化合物從聚酰胺柱上洗脫時(shí)大體有下列規(guī)律：（以下規(guī)

21、律也適用于黃酮類化合物在聚酰胺薄層上的行為 ）,（1）苷元相同，洗脫先后順序一般是： 三糖苷?雙糖苷?單糖苷?苷元（2）母核上增加羥基，洗脫速度即相應(yīng)減緩（3）不同類型黃酮化合物，先后流出順序一般是： 異黃酮?二氫黃酮醇?黃酮?黃酮醇（4）分子中芳香核、共軛雙鍵多者則吸附力強(qiáng)，故查耳酮往往比相應(yīng)的二氫黃酮難于洗脫。,聚酰胺柱層分離流程,聚酰胺分子中既有非極性的脂肪鏈，又有極性的酰胺基

22、團(tuán)，聚酰胺色譜具有雙重色譜性質(zhì)。用含水溶劑系統(tǒng)（如乙醇-水）洗脫時(shí)，符合氫鍵吸附規(guī)律，類似于反相分配色譜，苷先下，苷元后下。用有機(jī)溶劑系統(tǒng)（如氯仿-甲醇）洗脫時(shí)，類似于正相分配色譜，苷元先下，苷后下。,,3. 葡聚糖凝膠柱層析： 對于黃酮類化合物的分離，主要用兩種型號的凝膠：Sephadex-G型及Sephadex LH-20型。Sephadex G 適用于水系統(tǒng)Sephadex LH-20 適用于水及有機(jī)溶劑

23、系統(tǒng),葡聚糖凝膠分離黃酮類化合物的機(jī)理是： 分離游離黃酮時(shí)，主要靠吸附作用。凝膠對黃酮類化合物的吸附程度取決于游離酚羥基的數(shù)目。 分離黃酮苷時(shí)，則分子篩的屬性起主導(dǎo)作用。在洗脫時(shí)，黃酮苷類大體上是按分子量由大到小的順序流出柱體，葡聚糖凝膠柱層析中常用的洗脫劑有：(1) 堿性水溶液（如0.1mol/L NH4OH），含鹽水溶液(0.5mol/L NaCl等)。(2) 醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水（不同

24、比例）、正-丁醇-甲醇(3:1)、乙醇等。(3) 其它溶劑：如含水丙酮、甲醇-氯仿等。,,（二）梯度pH萃取法：與酚羥基酸性有關(guān) 梯度pH萃取法適合于酸性強(qiáng)弱不同的黃酮苷元的分離。根據(jù)黃酮類苷元酚羥基數(shù)目及位置不同其酸性強(qiáng)弱也不同的性質(zhì)，可以將混合物溶于有機(jī)溶劑（如乙醚）后，依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH水溶液萃取，來達(dá)到分離的目的。 酸性： 7，4?-二OH

25、 ? 7-或4?-OH ? （溶于）： 5%NaHCO3液 5%Na2CO3液 一般OH ? 5-OH 0.2%NaOH液 4%NaOH液）,pH梯度萃取分離法,5%碳酸氫鈉水溶液萃取,（三）系統(tǒng)溶劑分離法（溶劑萃取法）,（苷元）,（苷元、苷）,（苷）,,（四）根據(jù)分子中某些特定官能團(tuán)進(jìn)行

26、分離 在黃酮類成分的混合物中，具有鄰二酚羥基成分與無此結(jié)構(gòu)的成分，可用鉛鹽法分離。不具有鄰二酚羥基的成分可被堿式醋酸鉛沉淀，達(dá)到分離的目的。 與黃酮類成分混存的其它雜質(zhì)，如分子中有羧基（如樹膠、粘液、果膠、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等）或鄰二酚羥基（如鞣質(zhì)等）時(shí)，也可為醋酸鉛沉淀達(dá)到去雜目的。,具黃酮類化合物與鉛鹽生成的沉淀，濾集后按常法懸浮在乙醇中，通入H2S進(jìn)行復(fù)分解，濾除硫化鉛沉淀，濾液中可得到黃酮類化合物。但初生態(tài)

27、的PbS沉淀具有較高的吸附性，因此現(xiàn)多不主張用H2S脫鉛，而用硫酸鹽或磷酸鹽，或用陽離子交換樹脂脫鉛。有鄰二酚羥基的黃酮可與硼酸絡(luò)合，生成物易溶于水，借此也可與不具上述結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物相互分離。 在實(shí)際工作中，常將上述柱層析法與各種經(jīng)典方法相互配合應(yīng)用，以達(dá)到較好的分離效果。,第四節(jié) 黃酮類化合物的鑒定,硅膠TLC聚酰胺TLC雙向紙色譜法,雙向紙色譜法,第一向展開劑：醇性溶劑，如n-BuOH-HAc-H2O (B