載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對(duì)增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Proliferative vitreoretinopathy, PVR)是嚴(yán)重的致盲性眼病之一，臨床上復(fù)雜難治。為增加姜黃素的生物利用度并減少玻璃體腔注藥所可能引起的并發(fā)癥，本課題將首先制備載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞并對(duì)其體外藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行初步研究，進(jìn)而將制備成的載有不同劑量姜黃素的生物可降解鞏膜塞嵌置在兔眼鞏膜壁睫狀體平坦部對(duì)其與周?chē)M織的生物相容性及毒副作用及玻璃體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，最后通過(guò)玻璃體腔

2、注射自血制作PVR兔眼模型，觀察鞏膜睫狀體平坦部置入載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對(duì)兔眼PVR模型的防治效果，從而全面評(píng)價(jià)其防治PVR的可行性問(wèn)題，探討應(yīng)用姜黃素防治PVR更佳的給藥方式。本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述:
　　第一部分 制備載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞及其體外動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:制備一種可以嵌置在睫狀體扁平部鞏膜壁上，可以緩慢釋放姜黃素至玻璃體腔的生物可降解鞏膜塞形的藥物釋放系統(tǒng)并對(duì)其體外藥物動(dòng)力學(xué)作一初步研究

3、。
　　方法:應(yīng)用Octagon200振動(dòng)篩粉器將聚乳酸聚乙醇酸共聚物(polylactide-co-glycolide，PLGA)、姜黃素制成100um大小顆粒，將不同劑量的姜黃素與PLGA按1∶5均勻混合后置于鞏膜塞模具中壓制成鞏膜塞。再將模具連同其內(nèi)的鞏膜塞置于烤箱中，燒結(jié)溫度設(shè)置在55℃范圍，持續(xù)30分鐘。將制備好的載有不同劑量姜黃素的鞏膜塞置入裝有1.5ml平衡鹽溶液的玻璃試管內(nèi)，37℃溫浴，每24小時(shí)收集BSS姜黃素洗

4、脫液。試管中則加入新鮮BSS1.5ml，如此循環(huán)重復(fù)14天。應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)BSS洗脫液內(nèi)姜黃素藥物質(zhì)量濃度。
　　結(jié)果:制備成分別含有0.5mg、1.0mg、1.5mg三種劑量姜黃素的生物可降解鞏膜塞，直徑約1mm，長(zhǎng)約5mm。體外動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示以PLGA為載體物質(zhì)的姜黃素生物可降解鞏膜塞可持續(xù)釋放姜黃素。
　　結(jié)論:可以應(yīng)用PLGA作為載體物質(zhì)與不同劑量的姜黃素混合制備生物可降解的鞏膜塞形藥物

5、釋放系統(tǒng)，體外動(dòng)力學(xué)檢測(cè)其可穩(wěn)定釋放一定量的姜黃素14天，其中含有1.5mg、1.0mg姜黃素的生物可降解鞏膜塞在BSS液中的質(zhì)量濃度可在一定的時(shí)間內(nèi)持續(xù)高于15ug/ml。
　　第二部分 載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞的眼部組織相容性及毒性研究
　　目的:對(duì)載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入鞏膜壁后其對(duì)周邊眼部組織生物相容性及毒性問(wèn)題進(jìn)行研究以期對(duì)這種給藥方式在眼部應(yīng)用的安全性問(wèn)題進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　方法:共44只實(shí)驗(yàn)用兔，

6、其中32只實(shí)驗(yàn)用兔隨機(jī)分為對(duì)照組，0.5mg組，1.0mg組及1.5mg組4組，每組8只。對(duì)照組為選取每只兔的右眼只做鞏膜穿刺而不植入鞏膜塞。其余三組則選取每只兔的右眼結(jié)膜下鞏膜壁嵌置載有不同劑量姜黃素的鞏膜塞。其余12只兔隨機(jī)分成上述4組，每組3只，雙眼使用方法同上（本組供14d、28d、60d時(shí)摘取眼球使用）。分別于鞏膜壁嵌置鞏膜塞后1、7、14、21、28d測(cè)量各實(shí)驗(yàn)眼眼壓、應(yīng)用裂隙燈觀察結(jié)膜反應(yīng)、前房炎癥反應(yīng)以及角膜透明性，間接

7、檢驗(yàn)鏡觀察玻璃體視網(wǎng)膜情況，并在各檢查點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)眼進(jìn)行暗適應(yīng)ERG檢查。對(duì)在14d、28d、60d摘取的眼球行光鏡及電鏡組織學(xué)檢查。
　　結(jié)果:鞏膜塞植入后各檢查時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組與各劑量鞏膜塞組實(shí)驗(yàn)眼眼壓各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:應(yīng)用PLGA作為藥物載體的姜黃素生物可降解鞏膜塞植入鞏膜穿刺口，鞏膜塞與穿刺口間密閉性好，無(wú)滲漏，無(wú)炎癥反應(yīng)，對(duì)周邊組織無(wú)損傷，經(jīng)過(guò)1至2個(gè)月鞏膜塞自然降解，無(wú)需二次手術(shù)取出，可以作為姜黃素治

8、療PVR的新型給藥裝置。為更好的發(fā)揮姜黃素各種藥理活性提供了新的給藥形式。
　　第三部分 載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞在兔眼玻璃體腔內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:探討載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入眼內(nèi)后玻璃體內(nèi)的藥物釋放特點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。
　　方法:將22只新西蘭白兔隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)組及質(zhì)控組各3只兔（6只眼）和實(shí)驗(yàn)組16只兔。實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為2組，分別為1.0mg、1.5mg組，每組8只兔。標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控組動(dòng)物

9、不行鞏膜壁鞏膜塞置入操作，只行玻璃體抽取，實(shí)驗(yàn)組右眼于角膜緣后3mm鞏膜壁嵌入載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞，分別于鞏膜壁置入鞏膜塞后1d、7d、14d、21d、28d抽取并制備玻璃體待檢樣品。應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測(cè)玻璃體腔內(nèi)藥物質(zhì)量濃度。
　　結(jié)果:姜黃素與玻璃體內(nèi)源性物質(zhì)之間的色譜峰分離良好，姜黃素保留時(shí)間為4.3 min。提取回收率約90％，日內(nèi)、日間變異較小。
　　結(jié)論:載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞嵌置在

10、鞏膜壁后可以持續(xù)釋放姜黃素至玻璃體腔持續(xù)至少4周以上，藥物濃度可持續(xù)穩(wěn)定在姜黃素抑制RPE細(xì)胞增殖的最佳有效濃度15ug/ml以上，可以作為姜黃素抑制PVR的新型給藥方法。
　　第四部分 兔眼增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變模型的建立及相關(guān)因子的測(cè)定
　　目的:在藥物防治PVR的研究過(guò)程中，選擇一種操作簡(jiǎn)單、節(jié)約成本、成模率高的制作PVR模型的方法并應(yīng)用抗體芯片方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)眼玻璃體樣本中相關(guān)因子的表達(dá)。
　　方法:新西蘭白兔16

11、只，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組8只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼。所有實(shí)驗(yàn)兔眼在角膜緣后3mm處用鞏膜穿刺刀刺向玻璃體中心部，勿傷及晶狀體及周邊視網(wǎng)膜，用穿刺刀向兩側(cè)擴(kuò)大切口，切口與角膜緣平行達(dá)4mm，用8-0可吸收線間斷縫合切口后以2ml注射器從穿刺口進(jìn)針抽取0.2ml玻璃體。對(duì)照組注入0.2mlBSS液，模型組注入0.2ml自血。術(shù)后1、3、7、14、21和28d進(jìn)行裂隙燈顯微鏡、間接眼底鏡等眼科檢查;眼科B超檢查玻璃體和視網(wǎng)膜情況。分別于操作后

12、1d、7d、14d、21d、28d采取玻璃體樣本，應(yīng)用QAL-CYT-2芯片檢測(cè)各檢測(cè)點(diǎn)抽取的玻璃體樣本中IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-17、IL-21、MMP-9、leptin、MIP-1β、NCAM-1、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　結(jié)果:對(duì)照組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)無(wú)PVR發(fā)生。實(shí)驗(yàn)后各檢測(cè)點(diǎn)模型組與對(duì)照組均未檢測(cè)到MIP-1β的表達(dá)。
　　結(jié)論:兔眼距角鞏膜緣3mm處?kù)柲ご┐坛槿〔Ａw聯(lián)合玻璃體腔注射自血建立PV

13、R模型的方法操作簡(jiǎn)單，成模時(shí)間快，成模率高，可檢測(cè)到多種炎癥因子表達(dá)，可作為藥物防治PVR研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　第五部分 載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞對(duì)兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變及相關(guān)因子的抑制作用研究
　　目的:探討載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入鞏膜壁后對(duì)自血玻璃體腔注射制作的PVR病變程度及相關(guān)因子的抑制作用。
　　方法:選用新西蘭白兔30只，隨機(jī)分為模型組與治療組，每組各15只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼。模型組:玻璃體腔注射

14、自血;治療組:玻璃體腔注射自血+鞏膜壁嵌置載有1.5mg姜黃素生物可降解鞏膜塞。術(shù)后1d、3d、7d、14d、21d和28d使用裂隙燈顯微鏡觀察角膜、房水、晶狀體、前節(jié)炎癥反應(yīng)情況;使用間接檢眼鏡和B超檢查玻璃體視網(wǎng)膜情況。PVR分級(jí)采用FastenbergPVR分級(jí)方法分級(jí)。分別于鞏膜壁嵌置鞏膜塞后1d、7d、14d、21d、28d采取玻璃體樣本，應(yīng)用QAL-CYT-2芯片檢測(cè)各檢測(cè)點(diǎn)采取的玻璃體樣本中IL-1α、IL-1β、IL-8

15、、IL-17、IL-21、MMP-9、leptin、MIP-1β、NCAM-1、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　結(jié)果:各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)治療組PVR的發(fā)展程度及分級(jí)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;抗體芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果，各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)治療組IL-1α、IL-1β、IL-8、MMP-9、TNF、NCAM-1、leptin的表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。IL-17因子在14d時(shí)模型組為1.2±0.5pg/

16、ml，21d時(shí)模型組、治療組玻璃體中的表達(dá)分別為9.2±3.0pg/ml、6.2±2.1pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.148,P=0.004)，其余測(cè)試點(diǎn)模型組與治療組未檢測(cè)到該因子的表達(dá);7d、14d模型組、治療組玻璃體中IL-21的表達(dá)分別為6.0±2.2、3.8±1.3 pg/ml;10.0±3.0、6.8±1.9pg/ml，組間有顯著性差異(t=3.169，P=0.004; t=3.490,P=0.002)，其余檢測(cè)點(diǎn)未

17、檢測(cè)到該因子的表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)模型組、治療組均未檢測(cè)到MIP-1β的表達(dá)。治療組熒光掃描圖顯示熒光亮度或面積均低于或小于模型組。
　　結(jié)論:載有1.5mg姜黃素的生物可降解鞏膜塞置入自血玻璃體腔注射的實(shí)驗(yàn)眼鞏膜壁后，可以通過(guò)抑制IL-1、IL-8、TNF、MMP-9等細(xì)胞因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)兔眼PVR病變的抑制作用。
　　基于上述研究結(jié)果可以得出以下結(jié)論:應(yīng)用PLGA作為載體物質(zhì)制各載有姜黃素的生物可降解鞏膜塞，HPLC檢測(cè)體外及