增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的玻璃體蛋白質(zhì)組及其分子標(biāo)志物的研究.pdf

1、目的： 增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferativevitreoretinopathy,PVR)是導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗最主要的原因。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)，對(duì)原發(fā)性孔源性視網(wǎng)膜脫離伴PVR的玻璃體蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離和鑒定，建立PVR和正常眼玻璃體蛋白質(zhì)組圖譜，篩選能評(píng)估術(shù)前PVR嚴(yán)重程度和手術(shù)預(yù)后的血清分子標(biāo)志物。 方法： (1)二維液相色譜聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜(two-dimensional-liquidchr

2、omatographycoupledbytandemmassspectrometry,2D-LC-MS/MS)分離和鑒定PVR玻璃體的蛋白質(zhì)組：收集PVRB、C、D級(jí)患者的玻璃體原液和術(shù)前血清，正常捐獻(xiàn)眼玻璃體和健康人的血清為對(duì)照組。將相同等級(jí)的輕度PVR(PVRB級(jí))和嚴(yán)重PVR(PVRC、D級(jí))以及捐獻(xiàn)眼玻璃體樣本等量混合，丙酮沉淀過夜。重溶后測(cè)蛋白質(zhì)濃度，加入胰酶，37℃酶解過夜。過陽離子交換柱后進(jìn)行在線反向色譜，納噴霧質(zhì)譜鑒定，

3、MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索。 (2)雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometry,MALDI-TOF-MS)對(duì)PVR與正常玻璃體的差異蛋白質(zhì)組研究：實(shí)驗(yàn)樣本同(1)。將同一等級(jí)的玻璃體樣本等量混合，丙酮沉淀過夜

4、。再水化液重溶后，加至固相pH梯度凝膠電泳膠條(18cm，pH3-10)進(jìn)行水化，等電聚焦，100V/30min，3500V/4h，8000V/4h。平衡后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，30mA/6h。銀染后圖像分析。差異明顯(至少2倍以上的吸光度OD)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，質(zhì)譜鑒定后MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索。 (3)激肽原1在PVR玻璃體和血清中的驗(yàn)證：PVRB、C、D級(jí)和正常捐獻(xiàn)眼玻璃體樣本和相應(yīng)的血清樣本同(1)。同時(shí)，收集PV

5、RA級(jí)的玻璃體和術(shù)前血清樣本以及PVR術(shù)后不同狀態(tài)的血清樣本，包括環(huán)扎術(shù)后未愈者和硅油眼。對(duì)玻璃體和相應(yīng)的血清樣本分別進(jìn)行激肽原1的免疫印記分析(westernblottinganalysis，WB)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)。(4)類胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6(insulin-likegrowthfactorbindingprotein，IGFBP-6)在PVR的玻璃

6、體和血清中的驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)樣本同(3)。應(yīng)用WB和。ELISA對(duì)玻璃體和相應(yīng)的血清樣本進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： (1)在捐獻(xiàn)眼、輕度和嚴(yán)重PVR玻璃體中分別鑒定到129、97和137種蛋白質(zhì)。其中，35種為三者共有的蛋白質(zhì)，24種為PVR玻璃體特異蛋白質(zhì)。血漿中的高豐度蛋白質(zhì)，如絲氨酸蛋白酶抑制劑家族、補(bǔ)體成分等和一些細(xì)胞外蛋白質(zhì)在PVR玻璃體中明顯上調(diào)或增加；同時(shí)細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)微管蛋白以及參與糖酵解的酶，如丙酮酸激酶和烯醇化酶等

7、在PVR中明顯下調(diào)。在PVR特異的蛋白質(zhì)中，激肽原1是鑒定到的肽段數(shù)較多大的相對(duì)高豐度蛋白質(zhì)；而IGFBP-6與增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。 (2)捐獻(xiàn)眼、輕度PVR和嚴(yán)重PVR玻璃體2-DE圖譜分別分析到47、184和336個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，在13個(gè)明顯差異蛋白質(zhì)中成功的鑒定到7種蛋白質(zhì)。其中，烯醇酶2是捐獻(xiàn)眼特有的；甲狀腺激素結(jié)合蛋白單體和視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-bindingprotein，RBP)單鏈?zhǔn)窃趪?yán)重PVR玻璃體中特異

8、的蛋白質(zhì)；前列腺素D合成酶和RBP3前體是捐獻(xiàn)眼和PVR眼玻璃體共有的蛋白質(zhì)，輕度PVR時(shí)明顯增加，嚴(yán)重PVR時(shí)下調(diào)。血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，隨PVR嚴(yán)重程度增加而明顯上調(diào)。 (3)WB顯示激肽原1在PVR患者玻璃體和血清中檢測(cè)到而在正常捐獻(xiàn)眼和正常人的血清中未測(cè)到，且在PVRC、D級(jí)中明顯高于PVRB級(jí)。激肽原1可以在所有的PVR患者玻璃體和血清樣本中檢測(cè)到(24/24，100％)。ELISA顯示嚴(yán)重PVR患者玻璃體和血清中激肽

9、原1明顯高于輕度PVR(P＜0.05)。PVR患者術(shù)后6個(gè)月血清中激肽原l明顯下降(P＜0.05)，仍高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。但環(huán)扎術(shù)后未愈者血清中激肽原1明顯高于正常對(duì)照組和硅油眼(P＜0.01)，亦高于玻切術(shù)后6個(gè)月隨訪組(P＜0.05)。(4)WB顯示，IGFBP-6在PVR的玻璃體和血清中檢測(cè)到而在正常捐獻(xiàn)眼和正常人血清中未測(cè)到，且在PVRC、D級(jí)中明顯高于PVRB級(jí)。IGFBP-6可以在91.7％的PVR.患者玻璃體和

10、血清樣本中檢測(cè)到(除外2個(gè)PVRB樣本)。ELISA顯示嚴(yán)重PVR患者的玻璃體和血清中IGFBP-6明顯高于輕度PVR(P＜0.05)。PVR患者術(shù)后6個(gè)月血清中IGFBP-6的濃度明顯下降(P＜0.05)，與玻璃體術(shù)后硅油眼和正常對(duì)照組的血清中的濃度接近(P＞0.05)，但明顯低于環(huán)扎術(shù)后未愈組(P＜0.05)。 結(jié)論： (1)本研究提示PVR是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，玻璃體發(fā)生一系列的變化，有大量的新生蛋白質(zhì)生成、血漿蛋

11、白質(zhì)的侵入以及正常玻璃體的蛋白質(zhì)降解，證實(shí)了PVR的病程中存在血-視網(wǎng)膜屏障的破壞、細(xì)胞骨架的重塑、細(xì)胞免疫反應(yīng)參與以及玻璃體的能量代謝障礙。 (2)2D-LC-MS/MS和2-DE-MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)策略的聯(lián)合應(yīng)用可以互為補(bǔ)充，能夠更完整的揭示差異蛋白質(zhì)組的研究。 (3)激肽原1和IGFBP-6是候選的PVR血清分子標(biāo)志物，可用于PVR嚴(yán)重程度的臨床分級(jí)和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，并為預(yù)防PVR的藥物開發(fā)提供了新的靶向