增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的蛋白質組學研究.pdf

1、目的：采用蛋白質組研究技術，通過雙向電泳分離，比較增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)與正常人的玻璃體的蛋白質表達差異，通過質譜檢測分析差異蛋白質點。尋找與鑒定PVR特異性表達的蛋白質。 方法：本研究是建立在蛋白質雙向電泳(2-DE)技術和優(yōu)化各類實驗技術的基礎上，采用2-DE聯(lián)合串聯(lián)質譜(MS-MS)的技術路線進行了PVR與正常人玻璃體的蛋白質組學研究。PVR(c2-d1)期的患者玻璃體和正常人的玻璃體以相同加樣量進行雙向凝膠電泳

2、；一向等電聚焦，使用固相pH梯度凝膠條(IPGstritpH3-10NL)，膠內(nèi)重泡脹技術，聚焦總電壓時80kVh-85kVh；用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺兩步平衡；二向電泳采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(13％、1.5mm均一膠)；根據(jù)上樣量不同分別進行銀染和考馬斯亮藍染色；用Umax透射掃描儀獲取染色后的2-DE凝膠圖譜；將2-DE凝膠圖譜輸入計算機，通過Imagemaster軟件分析找到合適的差異蛋白質點；ABI4700TOF-TO

3、F串級質譜儀鑒定與分析所找出的差異蛋白質點，得到差異蛋白質的肽質量指紋(PMF)和肽序列標簽(PST)；用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，對得到的PMF和PST與數(shù)據(jù)庫進行蛋白同源查詢，獲取差異蛋白質的信息。結合雙向凝膠電泳相應點表觀等電點、分子量、匹配肽段和覆蓋率等進行綜合分析。 結果：PVR患者和正常人的玻璃體蛋白質表達主要分布在mw(30kd-97kd)pi(4-8)之間，Image

4、master軟件分析雙向電泳圖譜結果，兩圖譜顯示疾病組表達蛋白質為190±30個，而正常組表達蛋白質為260±37個。同一患者標本在不同實驗批次所得的分離圖譜，經(jīng)過軟件分析，兩圖譜匹配率達86.7％。PVR患者與正常人玻璃體蛋白質相比，其濃度較高，高豐度蛋白質所占的比例較大，在二維凝膠圖譜中，分離清晰的蛋白點較正常人少，但兩者在高豐度蛋白質高度相似。本實驗所提取的正常人玻璃體蛋白質標本蛋白質分離圖譜的比較也見有較好的相似性及可比性。PV

5、R不同分期患者間玻璃體蛋白質圖譜差異較小，有很大的相似性，圖譜匹配率達82.1％。差異表達點79個，其中疾病組特異性表達有11個差異表達性蛋白質進行串級質譜鑒定，通過對NCBInr數(shù)據(jù)庫檢索，再通過表觀等電點、分子量、匹配肽段和覆蓋率等分析，鑒定出9個蛋白質：分別是補體C4b、甲狀腺素轉運蛋白，以及PR02619、Humanserumalbumininacomplexwithmyristic等7個血清相關蛋白質。 結論：建立的玻