增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：采用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，通過雙向電泳分離，比較增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)與正常人的玻璃體的蛋白質(zhì)表達差異，通過質(zhì)譜檢測分析差異蛋白質(zhì)點。尋找與鑒定PVR特異性表達的蛋白質(zhì)。 方法：本研究是建立在蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)技術(shù)和優(yōu)化各類實驗技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用2-DE聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)的技術(shù)路線進行了PVR與正常人玻璃體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。PVR(c2-d1)期的患者玻璃體和正常人的玻璃體以相同加樣量進行雙向凝膠電泳

2、；一向等電聚焦，使用固相pH梯度凝膠條(IPGstritpH3-10NL)，膠內(nèi)重泡脹技術(shù)，聚焦總電壓時80kVh-85kVh；用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺兩步平衡；二向電泳采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(13％、1.5mm均一膠)；根據(jù)上樣量不同分別進行銀染和考馬斯亮藍染色；用Umax透射掃描儀獲取染色后的2-DE凝膠圖譜；將2-DE凝膠圖譜輸入計算機，通過Imagemaster軟件分析找到合適的差異蛋白質(zhì)點；ABI4700TOF-TO

3、F串級質(zhì)譜儀鑒定與分析所找出的差異蛋白質(zhì)點，得到差異蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋(PMF)和肽序列標(biāo)簽(PST)；用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，對得到的PMF和PST與數(shù)據(jù)庫進行蛋白同源查詢，獲取差異蛋白質(zhì)的信息。結(jié)合雙向凝膠電泳相應(yīng)點表觀等電點、分子量、匹配肽段和覆蓋率等進行綜合分析。 結(jié)果：PVR患者和正常人的玻璃體蛋白質(zhì)表達主要分布在mw(30kd-97kd)pi(4-8)之間，Image

4、master軟件分析雙向電泳圖譜結(jié)果，兩圖譜顯示疾病組表達蛋白質(zhì)為190±30個，而正常組表達蛋白質(zhì)為260±37個。同一患者標(biāo)本在不同實驗批次所得的分離圖譜，經(jīng)過軟件分析，兩圖譜匹配率達86.7％。PVR患者與正常人玻璃體蛋白質(zhì)相比，其濃度較高，高豐度蛋白質(zhì)所占的比例較大，在二維凝膠圖譜中，分離清晰的蛋白點較正常人少，但兩者在高豐度蛋白質(zhì)高度相似。本實驗所提取的正常人玻璃體蛋白質(zhì)標(biāo)本蛋白質(zhì)分離圖譜的比較也見有較好的相似性及可比性。PV

5、R不同分期患者間玻璃體蛋白質(zhì)圖譜差異較小，有很大的相似性，圖譜匹配率達82.1％。差異表達點79個，其中疾病組特異性表達有11個差異表達性蛋白質(zhì)進行串級質(zhì)譜鑒定，通過對NCBInr數(shù)據(jù)庫檢索，再通過表觀等電點、分子量、匹配肽段和覆蓋率等分析，鑒定出9個蛋白質(zhì)：分別是補體C4b、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白，以及PR02619、Humanserumalbumininacomplexwithmyristic等7個血清相關(guān)蛋白質(zhì)。 結(jié)論：建立的玻