RNA干擾抑制髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞株c-myc基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的： 體外研究RNA干擾對(duì)人髓母細(xì)胞瘤D341細(xì)胞株c-myc基因的沉默，探討SiRNA轉(zhuǎn)染濃度、轉(zhuǎn)染時(shí)間和目的基因表達(dá)之間的相關(guān)性；同時(shí)觀察沉默c-myc基因后，在一定轉(zhuǎn)染濃度、轉(zhuǎn)染時(shí)間，RNA干擾對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。 方法： 不同濃度c-myc SiRNA轉(zhuǎn)染D341細(xì)胞，24小時(shí)后抽取總RNA和總蛋白質(zhì)，分別以RT-PCR和Western-blot檢測(cè)C-myc mRNA和C-myc蛋白的表達(dá)；同

2、時(shí)在轉(zhuǎn)染后的24、48小時(shí)之后流式細(xì)胞儀檢測(cè)和凋亡的變化。另外以100nM的C-myc SiRNA轉(zhuǎn)染D341細(xì)胞，12、24、48、72小時(shí)之后抽取總RNA和總蛋白質(zhì)，RT-PCR檢測(cè)C-myc mRNA表達(dá)，Western-blot方法檢測(cè)C-mye蛋白的表達(dá)；同時(shí)細(xì)胞滴片，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果： 200nM、100nM、50nM、25nM濃度SiRNA轉(zhuǎn)染的D341細(xì)胞，C-mye RNA表達(dá)均下降，與空白對(duì)照

3、組和陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Westem-blot檢測(cè)C-myc蛋白表達(dá)量，隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，SiRNA對(duì)C-mye蛋白的沉默效應(yīng)增加。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加，在24小時(shí)，對(duì)C-myc在RNA水平沉默效應(yīng)最明顯，在蛋白水平則在48小時(shí)出現(xiàn)最高沉默效應(yīng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞SiRNA濃度在100nM時(shí)，24小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，G1期細(xì)胞分布在72％-78％，s期細(xì)胞分布在16％-23％，空白對(duì)照組S期細(xì)胞分布在32-36％，

4、G1期細(xì)胞分布在53-56％，細(xì)胞凋亡不明顯。免疫細(xì)胞化學(xué)染色，表明SiRNA對(duì)C-myc蛋白的抑制隨著濃度的增加效應(yīng)增加，在時(shí)間點(diǎn)上，48小時(shí)出現(xiàn)最高沉默效應(yīng)。 結(jié)論： 1．實(shí)驗(yàn)所選擇的轉(zhuǎn)染片斷，在RNA水平及蛋白水平均對(duì)C-myc基因?qū)嵤┝顺聊聊瘦^高，是有效的沉默片斷。 2．在25nM、50nM、100nM、200nM濃度范圍內(nèi)，隨著SiRNA濃度的增加，在RNA及蛋白水平均顯示，對(duì)目的基因的沉默越明

5、顯。低濃度SiRNA即可抑制目的基因的表達(dá)，SiRNA對(duì)目的基因的抑制與轉(zhuǎn)染濃度成線性相關(guān)。 3．在12、24、48、72小時(shí)內(nèi)，對(duì)C-myc基因在RNA水平達(dá)到最大沉默效應(yīng)是在轉(zhuǎn)染24小時(shí)，而在蛋白水平，則在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后出現(xiàn)最高沉默效應(yīng)。 4．SiRNA抑制C-myc的表達(dá)使細(xì)胞阻滯在G1期，S期細(xì)胞減少，使細(xì)胞由G1期到S期的轉(zhuǎn)化停滯。 5．沉默C-myc基因后，D341細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，但并不增加細(xì)胞凋