胃癌細(xì)胞CXCR1沉默前后差異蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、目的:通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選和鑒定CXCR1shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌MKN45細(xì)胞系(si-CXCR1-MKN45)與空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MKN45細(xì)胞系(si-Scrambled-MKN45)之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　方法:首先分別建立兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，將CXCR1 shRNA質(zhì)粒和空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入人源性胃癌細(xì)胞系MKN45，通過G418篩選，構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)CXCR1蛋白的細(xì)胞系(si-CXCR1-MKN45)和對照組細(xì)胞系

2、（si-Scrambled-MKN45）。通過real-time-PCR和Western-blotting檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞CXCR1的表達(dá)情況。然后分別抽提兩組細(xì)胞的總蛋白，每組蛋白平行進(jìn)行3次雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)，ImageMaster圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，獲得這兩個(gè)細(xì)胞系的蛋白裂解產(chǎn)物雙向凝膠電泳的差異表達(dá)蛋白質(zhì)圖譜，選擇其中具有兩倍差異表達(dá)以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)采用反射式

3、基質(zhì)輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)技術(shù)進(jìn)行分析。并用Western-blotting方法驗(yàn)證了其中5個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)蛋白質(zhì)Keratin8，NDPKA，HSP27，sorcin，hnRNPK在細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:在si-CXCR1-MKN45和si-Scrambled-MKN45兩組細(xì)胞系中，共識別了101個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，57個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在CXCR1沉默后表達(dá)下調(diào)，30個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，

4、6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)完全消失，另外出現(xiàn)了8個(gè)新的蛋白質(zhì)點(diǎn)。選擇其中兩組細(xì)胞中具有兩倍差異表達(dá)以上的29個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，成功鑒定出27種蛋白質(zhì)。根據(jù)功能可以將這些差異表達(dá)蛋白分為6類:1分子伴侶2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白3細(xì)胞骨架蛋白4轉(zhuǎn)錄蛋白5鈣結(jié)合蛋白6代謝相關(guān)酶類。分別為:HSP27,SET translocation,GrpE-like1,hnRNPC(C1/C2),hnRNPK,hCG2020155, clathrin light chai

5、n A, Keratin8,alanyl-tRNA synthetasevariant,importin subunit alpha-4, cardiac ventricular myosin, Alg-2,sorcin, NADH dehydrogenase, galactokinase, NDPKA,NDPKB,methylthioribose-1-phosphate isomerase,chymotrypsinogen,PMPCB

6、protein, phosphoserine phosphatase,KIAA0088,ATP synthase,Metaxin-2，Enoyl-Coenzyme A Hydratase。Western-blotting驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)NDPKA，HSP27，sorcin，hnRNPK蛋白在si-CXCR1-MKN45細(xì)胞系中的表達(dá)量明顯低于其在si-Scrambled-MKN45對照細(xì)胞系中的表達(dá)量，而Keratin8的表達(dá)量在si-CXCR

7、1-MKN45細(xì)胞系中明顯升高，與雙向電泳技術(shù)結(jié)果相一致。
　　結(jié)論:
　　1.鑒定出27種與CXCR1相關(guān)的蛋白質(zhì)，為深入研究CXCR1與胃癌的關(guān)系提供了進(jìn)一步證據(jù)。
　　2.鑒定出的差異蛋白功能涉及凋亡增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞代謝及耐藥等方面。通過對這些蛋白的進(jìn)一步研究，將有助于解析CXCR1基因表達(dá)缺失對胃癌細(xì)胞影響的分子機(jī)制，從而為尋找新的胃癌敏感治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　3.CXCR1表達(dá)差異可能在