胃癌細胞CXCR1沉默前后差異蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、目的:通過蛋白質組學研究，篩選和鑒定CXCR1shRNA質粒穩(wěn)定轉染胃癌MKN45細胞系(si-CXCR1-MKN45)與空載體穩(wěn)定轉染MKN45細胞系(si-Scrambled-MKN45)之間差異表達的蛋白質。
　　方法:首先分別建立兩種穩(wěn)定轉染細胞系，將CXCR1 shRNA質粒和空白質粒分別轉染入人源性胃癌細胞系MKN45，通過G418篩選，構建穩(wěn)定低表達CXCR1蛋白的細胞系(si-CXCR1-MKN45)和對照組細胞系

2、（si-Scrambled-MKN45）。通過real-time-PCR和Western-blotting檢測轉染細胞CXCR1的表達情況。然后分別抽提兩組細胞的總蛋白，每組蛋白平行進行3次雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)，ImageMaster圖像分析軟件進行圖像分析，獲得這兩個細胞系的蛋白裂解產(chǎn)物雙向凝膠電泳的差異表達蛋白質圖譜，選擇其中具有兩倍差異表達以上的蛋白質點采用反射式

3、基質輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF)技術進行分析。并用Western-blotting方法驗證了其中5個關鍵點蛋白質Keratin8，NDPKA，HSP27，sorcin，hnRNPK在細胞系中的表達情況。
　　結果:在si-CXCR1-MKN45和si-Scrambled-MKN45兩組細胞系中，共識別了101個差異表達的蛋白質點，57個蛋白質點在CXCR1沉默后表達下調，30個蛋白質點表達上調，

4、6個蛋白質點完全消失，另外出現(xiàn)了8個新的蛋白質點。選擇其中兩組細胞中具有兩倍差異表達以上的29個蛋白質點進行質譜分析，成功鑒定出27種蛋白質。根據(jù)功能可以將這些差異表達蛋白分為6類:1分子伴侶2信號轉導蛋白3細胞骨架蛋白4轉錄蛋白5鈣結合蛋白6代謝相關酶類。分別為:HSP27,SET translocation,GrpE-like1,hnRNPC(C1/C2),hnRNPK,hCG2020155, clathrin light chai

5、n A, Keratin8,alanyl-tRNA synthetasevariant,importin subunit alpha-4, cardiac ventricular myosin, Alg-2,sorcin, NADH dehydrogenase, galactokinase, NDPKA,NDPKB,methylthioribose-1-phosphate isomerase,chymotrypsinogen,PMPCB

6、protein, phosphoserine phosphatase,KIAA0088,ATP synthase,Metaxin-2，Enoyl-Coenzyme A Hydratase。Western-blotting驗證發(fā)現(xiàn)NDPKA，HSP27，sorcin，hnRNPK蛋白在si-CXCR1-MKN45細胞系中的表達量明顯低于其在si-Scrambled-MKN45對照細胞系中的表達量，而Keratin8的表達量在si-CXCR

7、1-MKN45細胞系中明顯升高，與雙向電泳技術結果相一致。
　　結論:
　　1.鑒定出27種與CXCR1相關的蛋白質，為深入研究CXCR1與胃癌的關系提供了進一步證據(jù)。
　　2.鑒定出的差異蛋白功能涉及凋亡增殖、信號轉導、細胞粘附、細胞代謝及耐藥等方面。通過對這些蛋白的進一步研究，將有助于解析CXCR1基因表達缺失對胃癌細胞影響的分子機制，從而為尋找新的胃癌敏感治療靶點奠定基礎。
　　3.CXCR1表達差異可能在