胃癌血清特異蛋白篩選、鑒定.pdf

1、研究目的： 胃癌是全球致死率最高的惡性腫瘤之一，雖然近年來其發(fā)病率有所下降，但全球每年仍大約有930，000新確診胃癌的病例，約有700，000例患者病人死亡，其中有2/3的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，我國就占了42％。故胃癌的及時診治顯得尤為重要。目前胃癌診斷最有價值的方法是胃鏡檢查。但胃鏡檢查屬侵入性檢查，有一定的危險性且患者依從性和耐受性差，不適宜作為常規(guī)篩選檢查。目前已發(fā)現(xiàn)的胃癌標(biāo)記物如癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原19-9(C

2、A19-9)、糖鏈抗原125(CA125)、糖鏈抗原50(CA50)及糖鏈抗原CA72-4等指標(biāo)診斷胃癌的敏感性、特異性均較低，用于術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測尚可，但用于臨床診斷價值有限。近年來隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段的不斷進(jìn)步，越來越多的研究希望運用蛋白質(zhì)組學(xué)手段尋找腫瘤標(biāo)記物。本研究旨在運用SELDI蛋白芯片技術(shù)篩查胃癌血清特異蛋白波峰，并鑒定其中診斷價值較高的特異蛋白波峰，以期為將來采用血清學(xué)檢查診斷胃癌提供新的標(biāo)記物。 研究方法：

3、 一、SELDI-TOF-MS胃癌血清特異蛋白波峰的篩選 (一)運用弱陽離子SELDI蛋白芯片檢測訓(xùn)練組，包括30例胃癌患者、16例良性慢性胃病患者(5例胃潰瘍和11例慢性糜爛性胃炎伴腸化生)及30例健康對照人血清的蛋白波譜。同時采用放免法檢測訓(xùn)練組被檢者的CEA、CA199、CA125腫瘤標(biāo)志物。 (二)運用生物信息學(xué)技術(shù)采集和分析被檢測標(biāo)本有意義的波峰參數(shù)。 (三)分別比較30例胃癌患者和16例慢性胃病患

4、者(胃潰瘍和慢性糜爛性胃炎)血清蛋白波峰差異、30例胃癌患者和30例對照血清蛋白波峰差異、30例胃癌患者和非胃癌患者46例對照血清蛋白波峰差異；以尋找鑒別胃癌價值較高的蛋白波峰；以上比較中共同的差異波峰為胃癌的特異性蛋白波峰； (四)繪制ROC曲線，并通過ROC曲線得到的臨界值，評估胃癌特異性蛋白波峰對胃癌的診斷價值；并比較它們和已知腫瘤標(biāo)志物診斷價值。 (五)分析其中的特異蛋白波峰值和胃癌分期的相關(guān)性，分析特異性蛋白峰

5、高低在與腫瘤胃癌有無淋巴轉(zhuǎn)移間的差異相關(guān)性、分析特異性蛋白峰在早期胃癌(Ⅰ-Ⅱ)和晚期胃癌(Ⅲ-Ⅳ)的表達(dá)差異。 二、SELDI-TOF-MS胃癌血清特異蛋白波峰的驗證 (一)運用弱陽離子SELDI蛋白芯片盲法檢測驗證組10例胃癌患者、慢性胃病患者(慢性糜爛性胃炎伴腸化生)和10例正常健康對照血清蛋白波譜，采集第一步試驗中胃癌特異性蛋白波峰的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)；檢測SELDI胃癌特異性蛋白波峰的重復(fù)性； (二)根據(jù)盲

6、法驗證的結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)胃癌特異性蛋白波峰的診斷價值。 三、SELDI-TOF-MS胃癌血清特異蛋白波峰的鑒定 (一)將10位上一步SELDI特異蛋白波峰的篩選中發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比5910蛋白波峰高表達(dá)的患者血清各100μl混為一份，運用弱陽離子Clinprot磁珠液體蛋白芯片技術(shù)檢測質(zhì)荷比為5910的特異蛋白波峰，并采用Clinprot磁珠液體蛋白芯片初步純化富集質(zhì)荷比為5910的蛋白。 (二)將磁珠液體蛋白芯片富集液混

7、合，室溫旋轉(zhuǎn)蒸干，進(jìn)行一級LC-MS分離后，一級MS中選取最強(qiáng)的母離子進(jìn)行MS/MS二級質(zhì)譜鑒定，采用使用數(shù)據(jù)分析軟件BioworksBrowser3.3.1 SPl進(jìn)行SequestTM檢索，檢索數(shù)據(jù)庫為IPI Human(3.45)，母離子誤差設(shè)定為50ppm，碎片離子誤差設(shè)為1Da，非酶切方式。 四、SELDI-TOF-MS胃癌血清特異蛋白驗證 通過比較自備的針對5910多肽段的多克隆抗體以及針對Fibrinoge

8、n alpha chain(即Fibrinopeptide A)的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，驗證5910肽段以及辨別在胃癌患者血清中升高的是片段還是母蛋白。 結(jié)論： 一、SELDI-TOF-MS是一種有效的尋找血清差異蛋白質(zhì)波峰的手段，其篩選得到的差異蛋白質(zhì)波峰可用于胃癌的診斷。 二、SELDI-TOF-MS血清特異蛋白質(zhì)波峰5910、5342及6437可能成為胃癌診斷的蛋白質(zhì)波峰。尤其5910的蛋白質(zhì)波峰，其診斷價值