胃癌血清特征性聚糖譜和差異蛋白篩選及RAGE基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn).pdf

1、目的：探討胃癌患者與健康對(duì)照人群血清糖蛋白聚糖譜差異，建立胃癌特征性血清聚糖譜，為進(jìn)一步尋找胃癌腫瘤標(biāo)志物及胃癌的診斷提供思路和基礎(chǔ)。
　　方法：分別收集胃癌患者和健康對(duì)照人群血清，采用凝集素芯片技術(shù)檢測(cè)血清蛋白聚糖親和信號(hào)，并應(yīng)用凝集素印跡技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)主要包含以下步驟：（1）分別獲得健康對(duì)照組及胃癌組患者的混合血清并去除混合血清中的白蛋白和IgG；（2）獲取的低豐度蛋白經(jīng)除鹽柱轉(zhuǎn)換溶劑體系后采用超濾管提高蛋白濃

2、度；（3）CY5熒光染料標(biāo)記待測(cè)蛋白后與凝集素芯片進(jìn)行雜交；（4）熒光掃描儀掃描凝集素芯片熒光信號(hào)并提取數(shù)據(jù)；（5）獲取的數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布且滿(mǎn)足方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用成組設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不滿(mǎn)足方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（6）凝集素印跡技術(shù)檢測(cè)LEL、PHA-L、RCA-I和STL四

3、種凝集素對(duì)血清糖蛋白的親和能力，驗(yàn)證凝集素芯片結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)共篩選出13種與腫瘤相關(guān)的差異凝集素；其中CAL（識(shí)別黏蛋白T/Tn抗原）、DSA（識(shí)別三、四天線結(jié)構(gòu)）、EEL（識(shí)別半乳糖(α-1,3)半乳糖結(jié)構(gòu)）、LEL（識(shí)別N-乙酰氨基葡糖低聚物結(jié)構(gòu)）、PWA（識(shí)別(GlcNAcβ4) n結(jié)構(gòu)）、PHA-L（識(shí)別β-1,6分支結(jié)構(gòu)）、RCA-I（識(shí)別末端Galβ1-4 GlcNAcβl結(jié)構(gòu)）、RCA-II（識(shí)別N

4、-乙酰半乳糖胺）、STL（識(shí)別N-乙酰氨基葡糖低聚物結(jié)構(gòu)）、UEA（識(shí)別α連接巖藻糖殘基）和VAL（識(shí)別β-D-半乳糖殘基）共11種凝集素在胃癌組中對(duì)血清糖蛋白親和力顯著高于健康對(duì)照組（P<0.05）；而CFL（識(shí)別N-乙酰半乳糖胺）和GNL（識(shí)別α-1,3甘露糖殘基）兩種凝集素在胃癌組中親和信號(hào)顯著低于健康對(duì)照組（P<0.05）。凝集素印跡技術(shù)證明LEL、PHA-L、RCA-I和STL四種凝集素的結(jié)果與凝集素芯片結(jié)果一致。
　　

5、結(jié)論：應(yīng)用凝集素芯片技術(shù)成功篩選出13種與血清糖蛋白親和力存在差異的凝集素，建立了胃癌血清糖蛋白特征性聚糖譜，提示血清糖蛋白特征性糖鏈改變與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，為進(jìn)一步尋找胃癌腫瘤標(biāo)志物及胃癌的診斷提供思路和基礎(chǔ)。
　　第二部分基于TMT技術(shù)的胃癌血清定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　目的：探討胃癌患者與健康對(duì)照人群血清中蛋白差異，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行篩選，為尋找胃癌血清腫瘤標(biāo)志物提供基礎(chǔ)。
　　方法：胃癌組和健康對(duì)照組每組各取10

6、例血清樣品混合，混合血清樣品去除白蛋白和IgG后，經(jīng)PD-10脫鹽柱除鹽。胰酶消化后的肽段進(jìn)行TMT同位素標(biāo)記。TMT標(biāo)記的混合肽段先采用高pH反相液相色譜分離，然后進(jìn)行低pH nano-HPLC-MS/MS分析。根據(jù)質(zhì)譜鑒定的肽段TMT相對(duì)定量值，篩選出表達(dá)增加1.2倍或減低0.8倍的差異蛋白；采用生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行篩選。
　　結(jié)果：胃癌組和健康對(duì)照組共鑒定出非冗余蛋白594種蛋白，其中篩選出差異蛋白105種。與健

7、康對(duì)照組相比，胃癌組中共48種蛋白表達(dá)上調(diào)，57種蛋白表達(dá)下調(diào)。采用生物信息學(xué)相關(guān)工具對(duì)差異蛋白進(jìn)行解析后發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要集中分布在細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外空間、質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)；生物學(xué)過(guò)程集中在介導(dǎo)抗原的結(jié)合、鈣離子結(jié)合、蛋白二聚體活化等；分子功能分類(lèi)主要負(fù)責(zé)天然免疫、凝血、細(xì)胞代謝過(guò)程、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞等。
　　結(jié)論：本研究采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析胃癌患者血清和健康對(duì)照人群血清，篩選出胃癌血清的差異蛋白表達(dá)譜，獲得一批

8、潛在的胃癌血清標(biāo)志物，為胃癌的診斷和藥物干預(yù)治療提供了潛在的靶點(diǎn)。
　　第三部分 sRAGE血清水平和RAGE基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)
　　目的：檢測(cè)RAGE基因rs2070600、rs184003、rs1800624和rs1800625四個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，并聯(lián)合血清sRAGE水平，探討廣西地區(qū)人群RAGE基因突變與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。
　　方法：本研究共納入200例胃癌患者和207例健康體檢者，采用PCR-

9、RFLP技術(shù)檢測(cè)RAGE基因rs2070600、rs184003、rs1800624和rs1800625四個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證基因型的準(zhǔn)確性。ELISA法直接檢測(cè)血清sRAGE水平。哈-溫平衡檢驗(yàn)納入的研究對(duì)象是否具有群體代表性。采用二元logistic回歸分析方法校正性別、年齡、種族、BMI、家族史、吸煙和飲酒等混雜因素，計(jì)算比值比和95％可信區(qū)間，分析血清sRAGE水平和RAGE基因多態(tài)性與胃癌發(fā)

10、病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1. rs2070600位點(diǎn)和rs184003位點(diǎn)的基因型分布符合哈-溫平衡定律（P值均大于0.05），表明研究對(duì)象具有較好的群體代表性。
　　2. rs2070600位點(diǎn)有GG、AG和AA共三種基因型，AG基因型可顯著增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，其OR=1.62，95%CI=1.03-2.58，P=0.038。聯(lián)合AG+AA基因型（顯性模型）與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（OR=1.83，95%CI=

11、1.01-2.39，P=0.044)。AA基因型和G等位基因與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性（P值大于0.05）。上述結(jié)果提示RAGE基因rs2070600位點(diǎn)基因突變?cè)黾游赴┑陌l(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　3. rs184003位點(diǎn)有GG、GT和TT共3種基因型，GT基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其OR=0.62，95%CI=0.39-0.99，P=0.048。TT基因型、GT+TT聯(lián)合基因型、GT+GG聯(lián)合基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性（P值均大于0

12、.05）。上述結(jié)果提示rs184003位點(diǎn)基因突變降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　4. rs1800624位點(diǎn)有TT、AT和AA共3種基因型，AT基因型、AA基因型、AA+AT聯(lián)合基因型、AT+TT聯(lián)合基因型和A等位基因與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性（P值均大于0.05）。
　　5. rs1800625位點(diǎn)有CC、CT和TT共3種基因型，CT基因型、TT基因型、CC+CT聯(lián)合基因型、TT+CT聯(lián)合基因型和T等位基因與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)

13、性（P值大于0.05）。
　　6.不吸煙人群RAGE基因rs2070600位點(diǎn)的AG基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其OR=1.71，95% CI=1.01-2.91，P=0.043。不飲酒人群RAGE基因rs2070600位點(diǎn)的AG基因型與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其OR=1.75，95%CI=1.03-2.97，P=0.037。
　　7. rs2070600位點(diǎn)AG基因型血清sRAGE濃度顯著低于健康對(duì)照組和胃癌組GG基因型血清s

14、RAGE濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs184003位點(diǎn)TT基因型sRAGE水平顯著高于健康對(duì)照組和胃癌組GG基因型sRAGE水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs1800624位點(diǎn)與rs1800625位點(diǎn)各基因型其血清sRAGE濃度之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均大于0.05）。
　　結(jié)論：RAGE基因rs2070600位點(diǎn)和rs184003位點(diǎn)突變與廣西地區(qū)人群胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。rs2070600位點(diǎn)突變與sRAGE血清濃度負(fù)相關(guān)并增加胃癌