胃癌血清蛋白標記物的篩選、鑒定及生物學特性研究.pdf

1、1、研究背景：
　　胃癌（Gastric Cancer）是世界上發(fā)病率最高的腫瘤之一，我國胃癌的發(fā)病率也居高不下。相對與國外而言我國的胃癌以局部進展期和晚期居多，早期患者較少，總體生存率明顯低于國外。如何提高胃癌患者的早診早治是目前國內研究的熱點問題。因為早期胃癌沒有明顯的臨床表現，胃癌的早期臨床表現也常常與胃炎相混淆，所以大多數胃癌患者即使腫瘤發(fā)展至進展期或者晚期，也沒有特異性臨床癥狀出現，因而依靠臨床表現診斷胃癌顯然無法實現。

2、目前在我國開展胃癌的早期診治尚未有一種快捷、有效的方法。雖然在日本等國家胃鏡篩查已經成為中年以上人群的體檢項目，但由于檢查費用高、存在一定痛苦及風險，在我國不能普及。一些常規(guī)的檢測指標諸如CEA、CA199和CA724等用于消化道腫瘤檢測的腫瘤標志性蛋白質，也由于在普通人群中篩查的敏感性和特異性均不高的原因只能用于部分胃癌患者的術后復發(fā)與轉移的監(jiān)測。目前尋找特異性腫瘤標記物，尤其是在外周血中尋找對于胃癌有明確特異性的標志性蛋白質分子具有

3、很高的臨床價值。
　　蛋白質組學（Proteomics）的概念早在1994年即被澳大利亞的研究人員Williams等提出，并首先將這一研究方法應用于科學研究。它研究的是生物體在一定階段所擁有的全部蛋白質，以及在生物體代謝的過程中不同蛋白質的變化。不僅包括單個細胞在受到某些調控因子后其擁有的全部蛋白質的差異性變化，也包括整個生物的機體在某些影響因素的作用下蛋白質的差異性變化。因為蛋白質作為基因轉錄的最終形式，不僅參與生命的的維持，更

4、是調節(jié)生命活動具體形式的執(zhí)行者。對于蛋白質譜的研究和完善有助于早期診斷某些疾病，也有助于研究治療這些疾病的生物學靶點和藥物。本研究從胃癌早期診斷入手，采用蛋白質組學研究方法對胃癌患者血清進行研究，以期尋找出特異性蛋白標記物，而有助于胃癌的早期診斷。再從可能出現的特異性蛋白質入手，探索新發(fā)現的蛋白質是否參與胃癌的生長調節(jié)，以及對此類蛋白的調節(jié)能否作為胃癌可能的治療手段。
　　本研究對象是胃癌患者的血清(分別是胃癌患者術前血清，胃癌患

5、者術后血清)。擬通過表明增強激光解析電離飛行時間質譜（Surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）技術對三組胃癌血清以及正常血清進行比對，尋找差異表達蛋白，構造出差異表達蛋白質譜圖，再運用聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electr

6、ophoresis，SDS-PAGE）技術對目標蛋白進行純化分離后，對目標蛋白用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF）技術進行鑒定。最終確定胃癌患者血清中具有特異性的蛋白標記物，并通過細胞培養(yǎng)和動物實驗研究明確其是否對胃癌細胞和組織的生長產生影響，為胃癌的診斷及

7、臨床治療提供了可能和依據。
　　2、研究目的：
　　通過蛋白組學技術篩選并鑒定胃癌患者血清中可能存在的特異性蛋白標記物，通過細胞培養(yǎng)和動物實驗研究明確其是否對胃癌細胞和組織的生長產生影響。
　　3、材料與方法：
　　3.1臨床及實驗資料
　　本研究材料收集鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院普通外科自2013年5月至2014年1月前來就診的60例首診胃癌患者，其中男性患者46例，女性患者14例，年齡42~84歲，平均年齡5

8、8±0.5歲。術前經胃鏡活檢病理證實為腺癌，CT、彩超等檢查排除遠處轉移，且無手術禁忌擬行手術治療，于術前入院和術后1月復查時各采集血清標本一次，分別設為術前組和術后組。所有患者采集標本前均未接受化療、放療等治療，手術后病理再次確認為胃腺癌，組織病理分型，14例患者高分化型腺癌，21例中分化型腺癌，25例低分化型腺癌。病理學診斷均經過兩位以上的病理學專家的證實。20例慢性萎縮性胃炎患者血清，40例健康志愿者血清。所有120例患者的血樣標

9、本均自清晨空腹狀態(tài)下抽取，血液抽取后將血樣放置于干燥試管中于室溫下靜置1小時使血液自然凝固，而后在離心機中以3000 r/min的速度進行離心15min，抽取離心沉淀后的上清液移至PE管中，再將提取物置入-80℃冰箱進行保存。本實驗通過了河南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會的倫理審查，受試者均已簽署知情同意書。
　　本實驗選取的MGC-803和HGC-27胃癌細胞株購買于中國醫(yī)學科學院的上海細胞庫。裸鼠BLAB/C nude購自北京維通利華動

10、物技術有限公司，選用四-五周齡裸鼠，雌性20只，雄性20只，體重12-15g。
　　3.2主要試劑及儀器
　　用于目標蛋白檢測的蛋白質生物芯片系統（Ciphergen PBS II+SELDI–TOF–MS）以及WCX2蛋白芯片購買于美國Ciphergen Biosystem公司。SELDI–TOF–MS相關試劑購買于美國Sigma公司?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI–TOF–MS）購于美國Kratos Ana

11、lytical公司。Apo C-I購買于中國澤溪源生物科技有限公司。真空冷卻離心濃縮系統（SPD SpeedVac）購于美國Thermo Electron公司。1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購于以色列BI公司，McCoy5A培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國GIBCO公司。胰蛋白酶購于中國索萊寶公司。熒光顯微鏡購買于日本Olympus公司。高速低溫離心機購于日本HITACHI公司。Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresi

12、s System和Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell購于美國Bio-Rad Laboratories公司。IBM小Series360服務器（S/N：99WLWX4）購于美國IBM公司。鼠抗人血清（antiserum TTHY，一抗）、兔抗人血清（antiserum apoC-3，一抗）、抗鼠血清（二抗）和抗兔血清（二抗）購于美國santa cruz biotechno

13、logy公司。PVDF膜購于美國Millipore Corporation公司。
　　3.3實驗方法
　　3.3.1胃癌血清蛋白標記物的篩選：
　　隨機選取40例胃癌患者和20例健康志愿者作為訓練組，用以篩選特征蛋白；其余20例胃癌患者、20例慢性萎縮性胃炎患者和20例健康志愿者作為測試組，用以驗證目標的有效性。采用SELDI-TOF-MS系統進行檢測，以2000Da至20000Da為設定的最佳數據收集范圍，收集實驗所

14、得到的每個樣本中差異蛋白質的m/z峰值數據，采用Wilcoxon秩和檢驗，根據計算到的P值大小進行差異化分析，進而發(fā)現各組之間具有差異性的蛋白峰值。采用非線性支持向量機(SMV)分類器對各個樣本質譜數據進行分析，建立判別模型，再采用留一法交叉驗證測試組60例患者所建立模型的有效性。
　　3.3.2胃癌血清差異性蛋白的純化及鑒定：
　　將處理好的血清標本用SDS-PAGE進行蛋白質的分離，切取相應的膠片部分，根據膠內酶解試劑盒

15、說明書酶解出目標蛋白。點樣在蛋白質芯片板上，采用MALDI-TOF/TOF進行鑒定，收集相應的肽質量指紋圖譜。通過Mascot搜索軟件，將采集的數據與SwissProt數據庫進行連接、比對數據及匹配尋找相應的特征性蛋白質，從而獲得相應的目標蛋白質。
　　3.3.3胃癌血清差異性蛋白質標記物的驗證：
　　將待測樣本根據BCA蛋白濃度試劑盒使用說明書采用微孔酶標儀法測定蛋白濃度，結果無明顯差異，采用等體積法加樣進行Western

16、 blot試驗，掃描負片，采用image proplus6.0軟件測定每條蛋白質負片的灰度，采用SPSS，version13.0統計軟件進行各組間灰度值的統計學差異。
　　3.3.4目標蛋白對胃癌細胞株增殖的影響：
　　培養(yǎng)生長良好，處于對數增殖期的胃癌細胞。一組用不含目標蛋白培養(yǎng)基，作為對照組，另外五組加入含不同濃度目標蛋白的培養(yǎng)基，除此之外，加一組只有培養(yǎng)基100ul不含細胞。取在第24h后開始，每隔24h，每孔加入cc

17、k-8試劑10ul，孵育1.5h，在酶標儀中以450nm吸光值，檢測其吸光度至72h。
　　3.3.5目標蛋白對胃癌細胞株荷瘤小鼠瘤體的影響：
　　選用BLAB/C Nude小鼠，雌性20只，雄性20只，體重12-15g。選用MGC-803細胞株，充分傳代擴增，取對數期細胞消化后重懸計數，保證每只小鼠可以注射5x106個細胞（0.2ml）。注射細胞懸液0.2ml至裸鼠背部皮膚下。SPF級動物中心飼養(yǎng)，定期觀察瘤體生長情況，測

18、量裸鼠體重及瘤體大小，2周后分組給藥。用1ml生理鹽水溶解目標蛋白10mg，保證濃度（10mg/ml）。每只裸鼠給藥劑量100mg/kg，給藥途徑選用尾靜脈注射。連續(xù)給藥5天，觀察裸鼠生命體征，瘤體大小及體重變化。1周后處死裸鼠，收集瘤體，稱重并測量瘤體大小，計算出抑制率。采用免疫組織化學方法檢測瘤體Ki67，Bcl-2和Bax的表達。
　　4、結果：
　　4.1胃癌血清蛋白標記物的篩選結果
　　對測試組60例標本的蛋

19、白質譜數據經過分析處理后得到特異性 m/z峰值（P<0.01）15個。其中在正常組呈低表達的為8個，呈高表達的7個。通過SVM進行篩選Youden指數最高的組合模型得到了 m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白。m/z峰位于6438和14222的蛋白質在正常組和術后組均呈高表達，在術前組則明顯低表達，m/z峰位于8622的蛋白在術前組呈高表達，在正常組和術后組呈低表達，聯合檢測此三種蛋白質，利用leave-1-out交叉檢測，

20、它們對胃癌患者和正常對照血清組的敏感性是97.12％，特異性是95.27%。盲法測試結果顯示m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白模型用于區(qū)分胃癌和非胃癌患者血清標本的敏感性為94.31%，特異性為93.68%，陽性預測值為95.12%。
　　4.2胃癌血清蛋白質標記物純化及鑒定的結果
　　對含有m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白質進行分離純化，將得到序列片段通過Mascot搜索軟件，與SwissPr

21、ot數據庫進行連接、比對、匹配，其分別屬于載脂蛋白C-I（apolipoprotein C-I，ApoC-I），轉甲狀腺素蛋白（Transthyretin,TTHY），載脂蛋白C-Ⅲ（apolipoprotein C-Ⅲ，Apo C-Ⅲ）。
　　4.3胃癌血清差異性蛋白質標記物的驗證結果
　　Western blot對胃癌患者術前組、術后組及正常對照組及的血清ApoC-I、TTHY和Apo C-III進行測定。對三組血清中目

22、標蛋白質進行條帶灰度值統計分析，結果為術前組與正常組蛋白質灰度差異有統計學顯著性（P＜0.05)，術前組與術后組蛋白質灰度差異有統計學顯著性(P＜0.05)。
　　4.4類載脂蛋白C-I對胃癌細胞株影響
　　類載脂蛋白C-I對胃癌細胞株HGC27、MGC803的增殖產生明顯的抑制作用，并且根據給藥濃度和給藥時間的增加呈現正相關的增殖抑制作用。
　　4.5類載脂蛋白C-I對接種腫瘤細胞的荷瘤小鼠瘤體影響
　　類載脂

23、蛋白C-I對接種MGC803腫瘤細胞的荷瘤小鼠瘤體生長具有抑制作用，在對照組中腫瘤的重量為1.2+0.2g，而在實驗組中腫瘤的重量為0.8+0.1g，抑制率為33.3%，統計學差異具有顯著性（P<0.05）。實驗組中反應增殖的指標Ki67和Bcl-2表達量較對照組明顯降低，而反映促凋亡活性的Bax呈現高表達。
　　5、結論：
　　1.m/z峰位于6438、14222和8622的蛋白質經過鑒定分別為Apo C-I、TTHY和A

24、po C-III，其表達強度變化與胃癌腫瘤負荷存在明顯相關性，為后期研究特異性蛋白標記物與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關系提供了新的思路。
　　2.聯合檢測Apo C-I、TTHY和Apo C-III三種蛋白質可有效區(qū)分胃癌和非癌患者，對胃癌的血清學診斷具有一定的價值和應用前景。
　　3.類載脂蛋白 C-I對胃癌細胞株和胃癌細胞株荷瘤小鼠瘤體具有抑制作用，對后期研究兩者的內在聯系提供理論基礎。
　　4.類載脂蛋白C-I有可能作為一