慢性心力衰竭尿液蛋白標(biāo)記物的篩選、鑒定及應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景：慢性心力衰竭(CHF)是由于心臟器質(zhì)性或者功能性疾病損害心臟射血和充盈能力而引起的一組臨床綜合征，以心功能不全、神經(jīng)內(nèi)分泌激活和外周血流分布異常為主要特征。慢性心衰是各種病因?qū)е滦难芗膊〉膰?yán)重階段，其患病率高，死亡率大，5年存活率與惡性腫瘤相仿，嚴(yán)重威脅著患者生命并嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，高額的治療費用給社會經(jīng)濟(jì)造成了巨大的負(fù)擔(dān)，成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。缺乏客觀診斷標(biāo)準(zhǔn)是心衰死亡率高的原因之一，慢性心力衰竭至今尚無診斷的“

2、金標(biāo)準(zhǔn)”，診斷心衰很大程度取決于醫(yī)生個人臨床判斷，主要依據(jù)臨床癥狀和體征。目前公認(rèn)的NYHA分級是最常用的評價心衰嚴(yán)重程度，預(yù)測心衰預(yù)后的心功能分級系統(tǒng)，但其評價依據(jù)是以病人自覺癥狀為主，其診斷的準(zhǔn)確率受到醫(yī)生進(jìn)行臨床判斷的主觀影響，同時也與醫(yī)生的從醫(yī)經(jīng)驗和患者的配合度相關(guān)。目前無創(chuàng)的客觀檢查手段如超聲心動圖所能檢測的LVEF雖有較大診斷價值，但只能起參考作用。尋找能夠反映心衰這一病理生理狀態(tài)的客觀指標(biāo)是當(dāng)前面臨的主要問題。心衰是一種慢

3、性和發(fā)展性疾病，促發(fā)心衰的因素有很多，根據(jù)神經(jīng)激素學(xué)說及炎性細(xì)胞學(xué)說，我們找到了以BNP/NT-proBNP，炎癥細(xì)胞因子（如C反應(yīng)蛋白，腫瘤壞死因子-α），心肌損傷標(biāo)記物（如肌鈣蛋白）為代表的一系列新的標(biāo)志物，推動了整體心血管疾病診治水平的提高;因此有必要在生命活動的直接執(zhí)行者蛋白質(zhì)領(lǐng)域上，尋找敏感性高、特異性好的蛋白生物分子標(biāo)志物。心力衰竭可由多種病理因素引起，在病理情況下蛋白質(zhì)的變化也是多種多樣的。心力衰竭直接相關(guān)的分子和細(xì)胞改變

4、與臨床上心功能受損、療效、衰竭進(jìn)程和患者預(yù)后的關(guān)系并沒有確定，不同病因引起的心力衰竭疾病過程，臨床表現(xiàn)，預(yù)后也有差異，這些差異必然是由其不同的蛋白質(zhì)特征決定的。直接對心力衰竭過程中蛋白組學(xué)的研究是揭示細(xì)胞生命本質(zhì)特征的重要方案，有助于了解心衰時心肌細(xì)胞功能障礙及代償作用的分子機(jī)制。本研究采用熒光差異雙向凝膠電泳(2D-DIGE)蛋白質(zhì)組學(xué)方法結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選并鑒定慢性心力衰竭和正常人群尿液差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并對候選差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行驗證及

5、進(jìn)一步的研究。探討慢性心衰的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找慢性心衰特異性分子標(biāo)記物，為其早期診斷，監(jiān)測預(yù)后及尋求新的治療靶點提供研究依據(jù)。
　　 第一部分慢性心力衰竭患者尿液雙向凝膠電泳圖譜的構(gòu)建
　　 1.目的:構(gòu)建穩(wěn)定性好，重復(fù)率及分辨率高的慢性心力衰竭尿液蛋白雙向電泳圖譜，為尿液蛋白組水平進(jìn)一步研究慢性心力衰竭奠定基礎(chǔ)。
　　 2.材料和方法:隨機(jī)選取慢性心力衰竭患者9例，其中心功能分級Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ級的心衰患者各3例。標(biāo)

6、本來源于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心血管內(nèi)科，明確診斷為慢性心衰的患者。患者納入標(biāo)準(zhǔn)按照Framingham Heart Study(FHS)的慢性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)。慢性心衰患者心衰嚴(yán)重程度按照美國紐約心臟學(xué)會(NYHA)分級法分級。囑咐符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者留取入院后前兩天清潔中段晨尿，留取后立即冷卻4℃，隨后移到-80℃儲存。將尿液樣本用丙酮或TCA/丙酮沉淀法提取，純化，濃縮蛋白，并用2D-Quant方法測定蛋白質(zhì)濃度。隨后按照雙向電泳手冊

7、進(jìn)行操作。上樣樣品分為四組:取100μg蛋白樣品丙酮處理組(IPG pH3-10NL，24cm)，100μg蛋白樣品TCA/丙酮處理組(IPG pH3-10NL，24cm)，100μg蛋白樣品聚焦60 KVh組(IPG pH3-10NL，24cm)和100μg蛋白樣品聚焦50 KVh組(IPG pH3-10NL，24cm)。第一向為等電聚焦，聚焦完畢后用平衡液平衡兩次，隨后膠條移至濃度為10.0％的SDS-PAGE膠上端進(jìn)行二向電泳，直

8、至溴酚藍(lán)達(dá)膠底線。按照固定、敏化、水洗、銀染、水洗、顯色、終止的步驟對電泳膠染色。用投射掃描儀進(jìn)行膠圖掃描，獲取2-DE凝膠圖像。
　　 3.結(jié)果
　　 1)對比聚焦總伏特數(shù)50 KVh組;聚焦總伏特數(shù)60 KVh組的電泳圖譜上不僅蛋白點較多，而且橫條紋也大大減少，分離效果較好。
　　 2)使用TCA/丙酮沉淀法較丙酮沉淀法的整個圖譜效果明顯好，背景干凈，清晰，圖譜的橫，豎條紋均較少，且圖上的蛋白質(zhì)點能夠清晰分辨

9、，以便進(jìn)行差異點的辨認(rèn)和鑒定等后續(xù)實驗。
　　 4.結(jié)論:尿液樣本采用TCA/丙酮沉淀法處理，第一向電泳聚焦60KVh的總伏特數(shù)能夠得到穩(wěn)定性好，分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，為進(jìn)一步從尿液蛋白組水平篩選出慢性心力衰竭相關(guān)蛋白研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　 第二部分慢性心力衰竭患者尿液表達(dá)變化蛋白質(zhì)的分離、篩選及鑒定
　　 1.目的:利用2D-DIGE和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒定技術(shù)對慢性心力衰竭組和正

10、常對照組尿液中的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，篩選及鑒定，為進(jìn)一步尋找敏感性高、特異性好的慢性心衰蛋白生物分子標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。
　　 2.材料和方法:本部分研究共納入正常對照組和慢性心力衰竭組尿液標(biāo)本各15例，其中心功能分級為Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ級的心衰患者各5例。慢性心力衰竭患者尿液標(biāo)本收集同第一部分。正常對照組標(biāo)本來源于南方醫(yī)院體檢中心健康受試者的清潔中段晨尿。入選標(biāo)準(zhǔn)為:既往體健，無長期服藥史，無重大疾病史的志愿者，無近期感染史，無吸毒及嗜酒

11、史。采用標(biāo)本混合法，提取兩組尿液總蛋白并定量后進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，Cy2標(biāo)記內(nèi)標(biāo)樣品，Cy3標(biāo)記正常對照組尿液蛋白樣品，Cy5標(biāo)記慢性心力衰竭尿液蛋白樣品。待樣品標(biāo)記好后進(jìn)行雙向電泳過程。電泳結(jié)束后，標(biāo)記有熒光染料的凝膠直接用Typhoon9410掃描儀掃描，獲取圖譜后用Decyder凝膠分析軟件進(jìn)行分析。挑選出28個兩組間具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)并且差異倍數(shù)＞1.5倍的顯著增加或者顯著減少的感興趣差異蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。利用考馬斯

12、亮藍(lán)染色的制備膠上對應(yīng)的差異點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
　　 3.結(jié)果
　　 1)成功利用熒光差異雙向電泳方法對慢性心力衰竭和正常對照兩組的尿液蛋白進(jìn)行分離，篩選并獲得滿意的熒光差異雙向電泳圖譜。
　　 2)運(yùn)用Decyder凝膠分析軟件對分析后，挑選出慢性心力衰竭和正常對照兩組28個差異倍數(shù)＞1.5倍的差異蛋白點作為質(zhì)譜鑒定的對象。
　　 3)共鑒定出20種不同的蛋白質(zhì)。在慢性心力衰竭組中7個升高表達(dá)的蛋白分別是

13、:鈣粘蛋白-1(CDH1)，鋅α2糖蛋白(AZGP1)，α1-酸性糖蛋白(ORM1)，人α1微球蛋白(AMBP)，免疫球蛋白1κ鏈C區(qū)(IGKC)，人免疫球蛋白輕鏈kappa(IGLC1)，GM2神經(jīng)節(jié)苷脂激活因子(GM2A);13個下調(diào)表達(dá)的蛋白分別是:尿調(diào)節(jié)素(UMOD)，激肽原-1(KNG1)，α1-淀粉酶(AMY1A)，維生素D結(jié)合蛋白(GC)，胰腺α-淀粉酶(AMY2A)，血清白蛋白(Serum albumin，ALB)，白細(xì)

14、胞彈性蛋白酶抑制劑(SERPINB1)，間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(ITIH4)，凝血酶原(F2)，鈣結(jié)合蛋白(CALB1)，硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白(HSPG2)，甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2(MASP2), CD59糖蛋白(CD59)。
　　 4.結(jié)論:順利利用熒光差異雙向電泳對慢性心力衰竭和正常對照兩組的尿液蛋白進(jìn)行分離，篩選及分析差異蛋白點，并成功鑒定出20種不同的蛋白質(zhì)，7個蛋白質(zhì)在慢性心力衰竭尿液中高表達(dá)

15、，13個低表達(dá)。為尋找敏感性高、特異性好的慢性心衰潛在的蛋白生物分子標(biāo)志物提供了重要的研究基礎(chǔ)。
　　 第三部分差異蛋白ORM1在慢性心力衰竭的臨床意義研究
　　 1.目的:在鑒定的20個差異蛋白中選取與慢性心力衰竭特異相關(guān)的尿液候選蛋白，并研究該候選蛋白與慢性心力衰竭疾病的聯(lián)系。
　　 2.材料與方法:首選利用生物信息學(xué)工具對鑒定的20個差異蛋白進(jìn)行分析，系統(tǒng)、科學(xué)地分析這些鑒定蛋白質(zhì)累積信息所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義

16、。根據(jù)生物信息學(xué)分析選定ORM1為候選蛋白。利用western blotting技術(shù)驗證ORM1在尿液中的表達(dá)，驗證其可靠性后，對62例正常對照組和176例慢性心力衰竭患者的尿液標(biāo)本用ELISA方法檢測ORM1蛋白濃度，其中Ⅱ級患者34例，Ⅲ級患者87例和Ⅳ級心衰患者55例。標(biāo)本來源于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心血管內(nèi)科，明確診斷為慢性心衰的患者。患者納入標(biāo)準(zhǔn)按照Framingham Heart Study(FHS)的慢性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)。慢

17、性心衰患者嚴(yán)重程度按照美國紐約心臟學(xué)會(NYHA)分級法分級。正常對照組標(biāo)本來源于南方醫(yī)院體檢中心健康受試者的清潔中段晨尿。定量檢測后，運(yùn)用ROC曲線分析尿液ORM1/Cr用來診斷慢性心力衰竭的臨界值及對應(yīng)的特異度和敏感度。此外，根據(jù)納入ELISA研究慢性心力衰竭患者臨床資料如:年齡，性別，伴有或無糖尿病，伴有或無高血壓，伴有或無冠心病，伴有或無心肌病，伴有或無腎功能損害，eGFR分級，NT-proBNP和和LVEF≥或＜50％等進(jìn)行分

18、析，進(jìn)一步分析ORM1與慢性心力衰竭之間的關(guān)系。
　　 3.結(jié)果
　　 1)生物信息學(xué)提示這20個差異蛋白共參與了1600個不同的生物學(xué)過程，其中前15個生物學(xué)過程包括:生長，誘導(dǎo)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)病機(jī)制，分泌，消化，定位，翻譯，凝血，死亡，RNA剪接，細(xì)胞凋亡，磷酸化和補(bǔ)體激活等。
　　 2)生物信息學(xué)分析及文獻(xiàn)挖掘提示ORM1可作為候選蛋白進(jìn)一步研究。
　　 3) ORM1尿液western blotti

19、ng結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，在慢性心力衰竭中高表達(dá)。
　　 4)慢性心力衰竭組的ORM1/Cr水平為6498.83±4300.21 ng/mg，顯著高于健康對照組2102.256±1069.24 ng/mg。當(dāng)ORM1/Cr為2484.98ng/mg水平，用其診斷慢性心力衰竭的敏感度為90.91％，特異度為85.48％。
　　 5)慢性心力衰竭的嚴(yán)重程度分組，Ⅱ級，Ⅲ級和Ⅳ級心衰患者尿液中ORM1/Cr水平有顯著性差異

20、，濃度依次分別為:3086.24±1474.91 ng/mg，6284.97±4088.02 ng/mg和8946.71±4298.05 ng/mg; Spearman檢驗提示其相關(guān)系數(shù)為0.499，尿液中ORM1水平隨著心衰程度的加重而升高。
　　 6)慢性心力衰竭患者臨床資料的分析中，未發(fā)現(xiàn)年齡，性別，伴有或無糖尿病，伴有或無高血壓，伴有或無冠心病，伴有或無心肌病，伴有或無腎功能損害，eGFR分級和LVEF≥或＜50％等分組