胃癌微環(huán)境差異蛋白質(zhì)篩選及表達機制.pdf

1、目的：胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。本研究旨在尋找胃癌微環(huán)境中差異蛋白質(zhì)分子，并探討其表達調(diào)控的機制，揭示微環(huán)境在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　方法：
　　1.采用激光捕獲顯微切割（LCM）技術(shù)，分別切取新鮮正常胃粘膜組織（NGM）和胃腺癌組織（GAC）中間質(zhì)，獲取高純度的NGM和GAC間質(zhì)總蛋白質(zhì)，同位素標(biāo)記（iTRAQ），結(jié)合二維液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜（2D LC-MS/MS）技術(shù)，鑒定NGM和GAC間微環(huán)境中的差異表達蛋

2、白質(zhì)分子。通過生物信息學(xué)方法，分析胃癌微環(huán)境蛋白質(zhì)分子間的相互作用。選取胃癌間質(zhì)中高表達蛋白質(zhì)（FN1和MCL1）和低表達蛋白質(zhì)（EMILIN1和COL1A1），運用Western blot和免疫組織化學(xué)染色方法，驗證NGM及GAC組織中蛋白質(zhì)組學(xué)實驗結(jié)果，分析GAC間質(zhì)差異表達蛋白質(zhì)分子的臨床病理學(xué)意義。
　　2.蛋白質(zhì)組學(xué)實驗結(jié)果，經(jīng)生物信息軟件分析，篩尋調(diào)控GAC間質(zhì)差異蛋白質(zhì)分子表達的miRNAs。選取其中的miR-125

3、b進行研究，采用qRT-PCR和原位雜交技術(shù)，檢測miR-125b在NGM和GAC組織中的表達，分析miR-125b表達與胃癌患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系；將miR-125b轉(zhuǎn)染于胃癌MGC-803細(xì)胞，通過細(xì)胞生長曲線繪制、Transwell侵襲、流式細(xì)胞儀、Western blot及裸鼠成瘤，分析miR-125b導(dǎo)入MGC-803細(xì)胞，對MGC-803細(xì)胞生長增殖、凋亡及侵襲的影響。Targetscan6.2軟件分析，預(yù)測miR-125

4、b可能參與調(diào)控胃癌的靶基因；采用熒光素酶基因報告檢測、qRT-PCR與Western blot方法，證實MCL1基因為miR-125b調(diào)控的靶基因；免疫組織化學(xué)染色，觀察注射miR-125b，荷瘤組織中MCL1表達水平；構(gòu)建MCL1 干擾載體，采用生長曲線繪制、Transwell侵襲實驗、流式細(xì)胞
　　儀與Western blot，觀察敲低MCL1基因表達，對MGC-803細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。
　　結(jié)果

5、：
　　1.本研究在胃癌間質(zhì)中總共鑒定出差異蛋白質(zhì)分子123個，其中表達上調(diào)56個，下調(diào)67個，這些蛋白質(zhì)涉及腫瘤相關(guān)的信號通路（如MAPK信號通路、VEF信號通路、p53信號通路等）、器官發(fā)育、細(xì)胞生長、增殖、凋亡、代謝、激應(yīng)、運輸及免疫等；部分蛋白質(zhì)在STRING網(wǎng)絡(luò)中呈現(xiàn)相互節(jié)點，兩兩間相互聯(lián)系；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，EMILIN1和COL1A1蛋白質(zhì)在胃癌組織中低表達，而MCL1和FN1蛋白質(zhì)則在胃癌組織中高表達。MC

6、L1和FN1在胃癌中高表達，與胃癌分化程度、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)，與EMILIN1和COL1A1表達則呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。
　　2.通過生物信息學(xué)軟件，預(yù)測調(diào)控胃癌微環(huán)境差異蛋白質(zhì)分子的micRNAs，分析顯示miR-125b調(diào)控多個蛋白質(zhì)；miR-125b在胃癌組織中低表達，其表達與胃癌組織的分化程度呈正相關(guān)（P<0.01）；miR-125b在TNM分期I-II期患者的陽性表達率高于III-IV期患者，

7、與胃癌患者TNM分期呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）；miR-125b表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（ P<0.01）；Kaplan-meier生存曲線分析顯示，miR-125b表達胃癌患者生存期相關(guān)，miR-125b高表達患者生存期長于miR-125b低表達組，miR-125b表達低，患者預(yù)后差（P<0.01）。
　　3.miR-125b導(dǎo)入MGC-803細(xì)胞，細(xì)胞生長速度減慢，侵襲能力降低，細(xì)胞凋亡率增加，Cleaved caspase

8、-3及Cleaved PARP表達增加（P<0.01），裸鼠荷瘤體積變小、重量減輕（P<0.01）；MCL1是miR-125b的靶基因，核苷酸結(jié)合位點是 MCL1基因3’UTR的2613-2620；miR-125b高表達，MGC-803細(xì)胞 MCL1基因表達降低（P<0.01）；敲低MCL1基因在MGC-803細(xì)胞的表達，細(xì)胞生長速度減慢，侵襲能力降低，細(xì)胞凋亡增加，Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表達增加（

9、P<0.01）；注射miR-125b，可抑制裸鼠荷瘤生長，荷瘤組織內(nèi)MCL1蛋白質(zhì)的表達降低（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.篩選胃癌微環(huán)境差異表達蛋白質(zhì)123個，其中上調(diào)56個，下調(diào)67個。
　　2.miR-125b在胃癌組織中低表達，其表達水平與胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后相關(guān)。
　　3.miR-125b可抑制MCL1基因表達，活化Caspase-3信號通路，降低MGC803細(xì)胞增殖與