p38參與調(diào)節(jié)Zymosan A誘導(dǎo)的相關(guān)細(xì)胞因子mRNA穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的：探討真菌多糖Zymosan A對(duì)其mRNA3’UTR含ARE的細(xì)胞因子（TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a）的誘導(dǎo)表達(dá)，研究p38對(duì)此類細(xì)胞因子mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，為真菌的致病機(jī)制與治療研究提供新思路與新靶標(biāo)。
　　方法：分離純化小鼠pMΦ，分別培養(yǎng)原代pMΦ及Raw264.7細(xì)胞株，提取蛋白樣品，采用western blot方法檢測(cè)Zymosan A誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路中p38、ERK、JNK等

2、激酶的磷酸化；用生物信息學(xué)方法分析Zymosan A誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的mRNA3’UTR，尋找富含ARE可能存在mRNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的細(xì)胞因子；采用real-time PCR方法，檢測(cè)Zymosan A誘導(dǎo)的mRNA3’UTR含ARE的細(xì)胞因子（TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a）的表達(dá)水平，及其相關(guān)細(xì)胞因子mRNA終止轉(zhuǎn)錄后的降解程度，觀察分析mRNA穩(wěn)定性；分別用p38抑制劑（SB202190）、ERK抑制劑（PD98

3、059）、JNK抑制劑（SP600125）阻斷信號(hào)通路中的靶向蛋白激酶，real-time PCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子（TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a）mRNA穩(wěn)定性的改變；分別用p38抑制劑（SB202190）、ERK抑制劑（PD98059）、JNK抑制劑（SP600125）阻斷信號(hào)通路中的靶向蛋白激酶，提取蛋白樣品，采用western blot方法分別檢測(cè)CREB、ERK及c-Jun的磷酸化，鑒定抑制劑阻斷作用，同時(shí)檢

4、測(cè)MK2的磷酸化，確定p38對(duì)MK2的調(diào)節(jié)作用；采用體外酶活實(shí)驗(yàn)，用Zymosan A處理細(xì)胞，提取蛋白樣品，加入λPP，30℃孵育5min，檢測(cè)TTP磷酸化，進(jìn)一步驗(yàn)證在Zymosan A誘導(dǎo)的細(xì)胞因子（TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a）mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)中，p38通過(guò)對(duì)MK2及TTP的磷酸化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：Zymosan A能激活MAPK信號(hào)通路，磷酸化p38、ERK、JNK等蛋白激酶及RNA結(jié)合蛋白

5、TTP，Zymosan A激活p38、ERK、JNK等蛋白激酶的最佳濃度為100μg/ml，同時(shí)，該濃度能有效誘導(dǎo)TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a等細(xì)胞因子的表達(dá)。生物信息學(xué)分析表明上述細(xì)胞因子mRNA3’UTR富含ARE。Zymosan A誘導(dǎo)的ARE-細(xì)胞因子，在終止轉(zhuǎn)錄4h后，mRNA降解為50％-60%，mRNA穩(wěn)定性良好。p38抑制劑（SB202190）處理后，結(jié)果顯示p38抑制劑能夠有效的抑制其下游MK2及T

6、TP的磷酸化，并使TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a的mRNA含量在轉(zhuǎn)錄后明顯減少，降解為10%左右，表明其mRNA穩(wěn)定性降低。體外酶活實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)加入磷酸酯酶后，TTP磷酸化消失。ERK抑制劑（PD98059）處理后，結(jié)果顯示ERK磷酸化被明顯抑制，但TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a的mRNA含量無(wú)變化，mRNA穩(wěn)定性無(wú)影響。JNK抑制劑（SP600125）處理后，結(jié)果顯示其下游轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化被

7、明顯抑制，但TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a的mRNA含量無(wú)變化，mRNA穩(wěn)定性無(wú)影響。
　　結(jié)論：
　　1．Zymosan A能激活MAPK信號(hào)通路，磷酸化p38、ERK、JNK等蛋白激酶，并誘導(dǎo)TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a等細(xì)胞因子的大量表達(dá)。
　　2．p38能夠增強(qiáng)Zymosan A誘導(dǎo)的TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a的mRNA穩(wěn)定性。其作用機(jī)制為p38通過(guò)磷