HL-60細(xì)胞核干細(xì)胞因子下調(diào)對p38MAPK通路相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、目的：
　　通過回顧本課題組前期研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)下調(diào)p53缺失型白血病HL-60細(xì)胞核干細(xì)胞因子（Nucleostemin，NS）后，該細(xì)胞p38MAPK基因發(fā)生明顯上調(diào)，本研究主要對p38MAPK通路中的相關(guān)蛋白的表達(dá)改變進(jìn)行檢測，分析NS與p38MAPK通路之間的相關(guān)性，初步探索NS下調(diào)后所導(dǎo)致該通路變化的可能原因，為進(jìn)一步探索NS非依賴性p53信號通路的具體機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　（1）本課題組前期已經(jīng)

2、構(gòu)建好針對NS基因的重組慢病毒載體（NS-RNAi-GV248）和陰性空載體，直接從公司病毒庫購買。
　　（2）根據(jù)HL-60細(xì)胞的合適的MOI值及病毒滴度，將NS-RNAi-GV248慢病毒載體轉(zhuǎn)染至人白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞內(nèi)以下調(diào)其NS的表達(dá)，通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的效率，采用WesternBlot技術(shù)測定HL-60細(xì)胞內(nèi)NS蛋白的下調(diào)情況。
　?。?）采用WesternBlot技術(shù)檢測慢病毒感染后空白對照組、陰

3、性對照組及實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞中p38MAPK通路中的相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，即p-p38MAPK/p38MAPK兩個比值的變化。
　　（4）采用ImageJ圖像處理軟件對目的蛋白條帶的灰度進(jìn)行比對分析并計算。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理分析，所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組獨(dú)立的樣本之間的比較采用單因素方差分析，而進(jìn)一步兩兩樣本之間的比較則采用Bonferroni法，校正檢驗(yàn)水平α’=0.0167，P<

4、0.05表示數(shù)據(jù)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?。?）根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，NS-RNAi-GV248慢病毒載體感染人白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞的最適MOI值為80。以MOI=80的條件感染HL-60細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察顯示慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80％以上；WesternBlot檢測結(jié)果顯示：慢病毒轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞的NS蛋白表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。
　?。?）WesternBlot技術(shù)的檢

5、測結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞p-p38/p38的比值（0.444±0.008）高于陰性對照組（0.286±0.016）和空白對照組（0.261±0.019）（P<0.05），表示NS表達(dá)下調(diào)后p38MAPK通路中的p-p38MAPK蛋白表達(dá)量增加。
　　結(jié)論：
　?。?）HL-60細(xì)胞內(nèi)p38MAPK通路中的p-p38蛋白的表達(dá)與NS表達(dá)下調(diào)呈負(fù)相關(guān)。
　?。?）NS非依賴性p53的作用過程可能與激活p